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上海市兽药饲料监察所 细菌内毒素检测方法介绍 上海市兽药饲料监察所 刘雅妮 2006年11月 内 容 基本概念 实验方法 操作注意事项 一、概念及相关知识 热原反应：病人在静脉给药15分钟后发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、昏迷、休克等症状。 热原：任何可以导致肌体发热的物质。 机理：外源性热原质通过内源性热原质起作用。 1942年，美国药典首次收载热原检查法，中国药典自第一版（1953年版）起收载。 所有注射用药品（肌肉注射、静脉注射）都要经过热原检查。 热原检查法的局限性： 1、重现性差。 2、对药物引起的增加、抑制作用无法控制。 3、不同细菌产生的热原质的致热域有差别。 4、非定量反应。 虽然不排除有其他热原物质存在，但细菌内毒素是最主要的热原物质。 细胞壁结构： 肽聚糖 脂蛋白 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 外膜 磷壁酸 脂多糖 细菌内毒素：革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。当细胞壁外膜结构完整时不具备生物活性，只有当细菌死亡，脂多糖脱落才显示出内毒素活性。 脂多糖结构：多糖O抗原＋核心多糖＋类脂A 内毒素的量值： 1、内毒素单位（EU） 1982年FDA将当时美国代号为EC－2的内毒素标准品规定为5EU/ng。1983年内毒素单位（EU）被USP正式引用。 2、国际单位（IU） WHO先后两次组织协作标定，建立内毒素国际标准品，其中第二批内毒素国际标准品适用于所有内毒素检查法，且明确1IU＝1EU。 鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一带。 鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的敏感试剂。 鲎试剂与内毒素反应机理 细菌内毒素检查法 凝胶法 浊度法 光度法 显色基质法 重现性好 能定量 能控制药物的增强/抑制干扰 操作简便。节省时间 二、细菌内毒素检测之凝胶法 实验程序 1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验（新药或新方法） 5、供试品内毒素限量检查 实验材料及用具 1、仪器 试剂 1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号 2、内毒素工作标准品 3、内毒素检查用水 4、三效热原灭火剂 5、75％乙醇 常用英文缩写 BET：细菌内毒素检查 BET水：细菌内毒素检查用水 MVD：供试品最大有效稀释倍数 NC：阴性对照 MVC：供试品最低有效浓度 PC：阳性对照 λ：鲎试剂灵敏度 L：供试品细菌内毒素限值 灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。 试验举例：内毒素工作标准品为100EU/支； 待测鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml。 1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75％酒精擦拭后启开，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min后进行稀释，步骤如下(箭头下方为加入BET水量)： 2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml，则取若干支，按标示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分装于标准玻璃试管（10mm×75mm），将试管按如下形状排列。 3、加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。 反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动混匀，置37 ℃水浴中保温60±2min，将每管拿出缓缓倒转180°，凝胶不变形为“＋”，凝胶不能保持完整为“－”。 当2.0λ四支管都为阳性，0.25λ四支管都为阴性时，试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度λc ： λc＝lg-1(∑X/4) （X:反应终点浓度的对数值。）