学术讲座(免疫组化)课件.ppt

免疫组化技术及 操做关键介绍 ; ; ;4;卵白素（avidin） ：鸡蛋白中的一种碱性蛋白，分子量为 68 kD，属于糖蛋白。 生物素（biotin），机体中的一种物质，又叫维生素H。 Avidin 和biotin 之间有很强的天然的亲和性。一个avdin分子有4个biotin的结合位点。 Biotin还可以和抗体IgG的Fc段结合，不影响IgG的活性。同时，生物素经活化后也可和过氧化物酶或ALP等结合，而不影响酶的活性。;;链霉亲和素（strept avidin），从链霉菌培养物中提取，比 avidin更好。 等电点接近于6.5，近中性，与被检查组织的非特异结合很少。 与Biotin形成复合物，穿透组织能力强。 用strept avidin 替代 avidin 的技术 SABC 法 SP法（Streptavidin-Peroxidase）; Envision法 （标记的葡聚糖聚合物法） 最敏感的方法，不受内源性生物素影响;一抗：鼠抗、兔抗 二抗：抗鼠、抗兔、兔鼠同抗 示踪剂：金属、荧光素、酶（辣根过氧化物酶HRP常用） ; ; ; ; ;切片放在金属架上(不宜太密) *高压锅加入0,01M 枸橼酸钠缓冲液3L, 煮沸 *金属架放在枸橼酸钠缓冲液内, 加盖, 加压1-5’ *自来水浴冷却高压锅 *自来水洗--Tris buffer ; 抗原修复是免疫组化发展史上的一个里程碑 甲醛固定造成蛋白之间交联，加热打断交联物暴露抗原，达到修复的目的。 现在，抗原修复已应用到流式细胞术、原位杂交、免疫电镜等过程中。; 蛋白酶消化 * 0.1% 胃蛋白酶 30’ * 0.01-0.1% 胰蛋白酶 15’-2小时 * 0.0025% 链酶蛋白酶 4-6’; ;内源性HRP和BIOTIN; ;（1）冰冻组织中存在内源性生物素。 （2）经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭。 （3）加热抗原修复可造成内源性生物素暴露。 （4）内源性生物素暴露的强度各不相同。 （5）内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布 也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中。 （6）内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺 上皮组织，亦存在部分非上皮组织。 （7）内源性生物素不仅存在人体组织，也存在大鼠组织。 （8）内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增 加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA。 （9）热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭。;1、进行内源性生物素封闭，并成为常规。 可采用蛋清或卵白素作为封闭剂。 2、或采用非生物素检测系统，如EnVision等。 3、应坚持使用阴性对照。; ; 染色---分步向组织片上滴加抗体 一抗、二抗、复合物 显色 ; ;二抗及以后的试剂为试剂盒，浓度不要调整。但要决定用什么厂家、品牌的试剂盒。 试剂盒 抗兔、抗鼠、抗兔/鼠 什么工作原理 SABC、SP、 Envision 厂家：迈新（福州）、Dako等 ; ;辣根过氧化物酶 ;3，3’—二氨基联苯胺(DAB)为棕褐色 3—氨基—9—乙基卡巴唑(AEC)为红色 4—氯—1—苯酚(CN)为蓝色 DAB是广泛应用的电子供体，产物既不溶于水，又不溶于有机溶液，可长期保存。其终产物具有嗜锇性，经锇酸处理后电子密度增加，适用于电镜下观察。但DAB的缺点是具有潜在的致癌性，所以应尽量减少吸人和接触次数，并严格管理废液。 AEC室温下较稳定，产物不溶于水，但溶于有机溶剂，所以不能进行脱水等处理；又因其需用水溶性封固剂，时间长易褪色，限制了其应用。 ;显色的酶 底物 显示颜色 封片 辣根过氧化物酶 H2O2/DAB 棕色 中性树胶 H2O2/AEC 红色 甘油 碱性磷酸酶 NBT/BCIP 深蓝色 甘油 ;碱性磷酸酶Alkalinephos phatase AKP ?? 分子100kDa，穿透细胞组织的能力较弱。某些组织细胞内含有较高的内源性碱性磷酸酶， 对IHC染色会产生一定的干扰 。 AKP主要用于血涂片或骨髓涂片的白细胞相关检测。 AKP的呈色反应的敏感性要比HRP高2—3倍，显色时间可从30min到48h，可与HRP组合进行IHC的双重或多重标记