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精液冷冻技术 精子冷冻技术 精子冷冻的历史 精子冷冻保存的目的 精子冷冻保存的基本原理 冷冻保护剂的作用机理 冷冻的程序和方法 影响精液储存的因素 精液冷冻的历史（一） 探索 1776年，Spallanzani发现精液在自然冰雪中冷冻后复温部分精子恢复活力 1938年，Jahnelv 发现精液储存于-79℃ 的玻璃管40天后复温部分恢复活力 1940年，Shettles置精液于毛细玻璃管内-196℃ 储存，存活率不超过10% 突破 1949年，Polge等发现用甘油作为冷冻精子的保护剂 精液冷冻的历史（二） 奠基 1954年后的十年中，Sherman发明了使用10%甘油作保护剂，用-196℃ 液氮蒸气作制冷剂的方法，获得76%的冷冻生存率，得到普遍认可 发展 在Sherman发明的方法基础上，从冷冻方法、保护剂种类等方面的研究发展迅速 稳定 经过多年的发展，精子冷冻技术相对稳定，探索不止 精液冷冻保存的目的 供精者的精液 生育力保存 不育症治疗 最大限度降低传染疾病的传播 优选精子 精液冷冻的原理（一） 一、冷冻精液长期储存的原理 一定的低温条件下 细胞内的分子运动速度减慢甚至停止 细胞代谢降低，处于休眠状态 一般认为-196℃ 的液氮是安全的 精液冷冻的原理（二） 二、冷冻对精子的损伤机理 1、溶质损伤效应：（慢速冷冻损伤） 精液冷冻的原理（三） 2、冰晶的机械损伤效应 ：（快速冷冻损伤） 精液冷冻的原理（四） 三、精液冷冻的基本原理 冷冻损伤是肯定的 在两种损伤之间寻找平衡点，即最佳的降温速率 使两种损伤的总和达到最小，得到最大的冷冻生存率 实现起来非常困难 冷冻保护剂的出现是一大突破 冷冻保护剂的作用机理（一） 一、冷冻保护剂的分类 1.根据化学结构分类： 醇类、酰胺类、高分子多糖类、单糖类、蛋白质类、 无机盐类等 2.根据作用机理分类： （1）渗透性冷冻保护剂：丙三醇、DMSO、乙二醇等 （2）非渗透性冷冻保护剂：果糖、蔗糖 、卵黄、白蛋白等 冷冻保护剂的作用机理（二） 二、渗透性冷冻保护剂的作用机理 1、渗入细胞内，降低细胞内外渗透压的差距。当细胞外冻结时，减轻细胞皱缩的程度和速度 2、细胞外保护剂的存在，可以降低细胞外液中溶质的浓度，减少高浓度溶质对细胞的损坏 3、能与细胞内水分及电解质结合的特性，导致水合结构蛋白的稳定，发挥抗冻作用 4、仅对慢速冷冻有保护作用 冷冻保护剂的作用机理（三） 三、非渗透性冷冻保护剂的作用机理 不能进入细胞，通过维持细胞膜的稳定起保护作用 冷冻时促进细胞内水分外溢，细胞发生皱缩，从而减少 了细胞内的冰晶形成 对快速冷冻和慢速冷冻都有保护作用 卵黄的作用：卵磷脂能稳定精子的细胞膜，阻止顶体膜破裂，抵抗“温度休克” 冷冻保护剂的作用机理（四） 四、冷冻保护剂的联合作用 1.冷冻保护剂剂量增加，其低温保护作用增强 2、冷冻保护剂的毒性作用 3、两种毒性机理不同的冷冻保护剂合用，可以达到相同的效果，而减少毒性作用 4.渗透性冷冻保护剂与非渗透性冷冻保护剂联合使用 冷冻的程序和方法（一） 一、冷冻过程中精子通过的温度阶段 温度休克阶段 室温~+5 ℃ 冰晶的潜热阶段 +5 ℃ ~-5 ℃ 冰晶的形成阶段 -5 ℃ ~-15 ℃ 再结晶阶段 -15 ℃ ~-80 ℃ 储存阶段 -80 ℃ ~-196 ℃ 冷冻的程序和方法（二） 1、温度休克阶段 温度休克：指细胞不是由于直接的冷却作用，而是由于温度急剧变化而造成的损害。 许多种属的细胞比较明显，如牛精子在2 ℃/分的降温速率下，就可能死亡 人类精子对温度休克有相当的抵抗力，1℃/分的降温速率比较合适 2、冰晶的潜热阶段 在通过+5 ℃ ~-5 ℃ 的温度阶段时，由于冰晶形成放出热量，温度突升高。为了减少潜热释放、温度升高对精子的损伤，应快速通过。 冷冻的程序和方法（三） 3、冰晶形成阶段 精液作