免疫学溶血实验报告.docx

免疫学溶血实验报告 　　溶血性实验　　实验目的：通过本实验认识溶血现象，并掌握溶血性实验常规的体外试管法的基本操作　　实验原理：溶血是指红细胞破裂、溶解的一种现象。药物制剂引起的溶血反应包括免疫性溶血与非免疫性溶血。免疫性溶血是药物通过免疫反应产生抗体而引起的溶血，为II型和III型变态反应；非免疫性溶血包括药物为诱发因素导致的氧化性溶血和药物制剂引起的血液稳定性改变而出现的溶血和红细胞凝聚等。溶血实验室观察受试物是否会引起溶血和红细胞聚集等反应。　　有些药物由于含有溶血性成分或物理、化学、生物等方面的原因，在直接注射入血管后可产生溶血现象；有些药物注入血管后可产生血细胞凝聚，引起血液循环功能的障碍等。有些中草药含有皂苷等成分，具有溶血作用。凡是注射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血的药物制剂，均应进行溶血性实验。实验方法　　1.2%红细胞悬液的制备取新鲜鼠血10~20ml，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶　　中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白质，使成脱纤血液。加入生理盐水100ml，摇匀，1000~1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤2~3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水配成2%的混悬液(红细胞2ml，加生理盐水至100ml)，供试验用。　　2.取10ml干净玻璃试管7支，编号，1至5号管为供试品，6号管为阴性对照　　管，7号管为阳性对照管(完全溶血对照)。按表1所示，依次加入2%红细胞悬液。0。9%氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即置(37±0。5)℃的恒温水浴中进行温育，观察并记录各管的溶血情况。开始每隔15分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，一般观察3小时。　　表1溶血实验设计表　　表2溶血试验结果判断标准　　全溶血溶液澄明，红色，管底无红细胞残留　　部分溶血溶液澄明，，红色或棕色，底部有少量红细胞残留;镜检红细胞稀少或变形不溶血红细胞全部下沉，上清液体无色澄明;镜检红细胞不凝聚红细胞凝聚溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散　　当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生时，若受试物管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，则受试物可以注射使用，若受试物中的溶液在3小时内发生溶血或聚集，则受试物不能注射使用。　　注：—表示无溶血，+表示部分溶血，++表示全溶血注意事项：　　溶血反应发生机制复杂，目前尚无标准的临床前体内实验方法全面评价药物制剂的溶血反应，因此在长期毒性研究中应该兼顾考虑制剂的溶血性，注意观察溶血反应的有关指标和体征，如出现溶血是，应进一步研究。　　《免疫学基础及实验技术》　　实验报告　　姓名:姚丽君　　专业：针灸推拿学　　年级：XX年研究生　　实验室：免疫试验室　　时间：XX年1月12日　　教师：李永念老师　　免疫学教研室　　人血清I的提取及鉴定　　一．主要原理：　　离子交换层析提取人血清IgG：离子交换剂采用DEAE-纤维素，是表面交联有　　二乙基乙胺基团的纤维素，本身带有真电荷，能吸附阴离子。DEAE-纤维素悬浮在PH高于，克分子浓度低的缓冲液内，置备成层析柱。人血清经过磷酸缓冲液透析平衡后，其中的IgG不带电荷或仅带少量电荷，其他的蛋白质则主要带负电荷，这样的血清样品通过相同缓冲液平衡好的DEAE-纤维素柱，除IgG以外的血清蛋白都吸附在柱上，仅IgG最易形成吸附-解离-再吸附-再解离的状态，因此能随洗脱液一起最早从柱中流出，收集洗脱液获得IgG。　　血清I鉴定：以收集的洗脱液为抗原，与兔抗人IgG做琼脂双扩散实验，可根　　据沉淀线的形成确定IgG抗原性。用免疫电泳法使血清中各种蛋白的分子大小以及电荷状态、电荷量均有差异，因而它们的泳动速率也不相同，根据在凹槽中加入免抗人血清，上下两孔加入用蔗糖包埋法进行浓缩后的浓缩液和正常人血清，经一段时间后出现沉淀弧，根据沉淀弧的情况来检测所获的IgG的纯度。用754型分光光度计于280nm紫外光源测定洗脱液光密度值，根据IgG的E1cm1%=(OD)公式，可计算出收获的IgG含量，并推算出所获得IgG的百分率。　　二．主要材料：　　1．NaOH、HCL、%NaCL按常规配制　　2．DEAE-纤维素健康人全血　　3．磷酸缓冲液　　4．20%三氯醋酸水溶液按W/V比例配制　　5．蔗糖　　6．巴比妥纳-巴比妥缓冲液，2MNaCL水溶液　　7．%琼脂凝胶　　8．布氏漏斗、抽滤瓶、水泵、试管，烧杯，玻璃棒，滤纸试纸、蝴蝶铁架、透　　析袋、离心机，746-电泳仪、754型分光光度计　　三、操作步骤：　　DEAE-纤维素预处理：　　1、称取DEAE-纤维素1２克，均匀撒在事先盛有150ml的烧杯中，人