基因工程第三章分子克隆载体课件.pptVIP

基 因 工 程;第三章 分子克隆载体教学目的和要求:本章主要阐明用于核酸操作的各种载体:质粒载体、噬菌体载体和单链丝状噬菌体载体等。通过本章的学习要求学生了解质粒的基本特性，λ噬菌体的分子生物学，穿梭载体、整合载体、解离载体等其它载体；理解大肠杆菌表达载体；掌握质粒载体的工作原理，噬菌体载体种类及工作原理，粘粒载体、噬菌粒载体的工作原理。重点、难点：质粒载体、噬菌体载体的种类和工作原理。教学方法：讲授、讨论、计算机辅助教学等;本章思考题：1.列举质粒载体必须具备的4个基本特性。 2.什么叫穿梭载体？3. M13系列载体具有哪些优缺点?4.黏粒载体具有哪些特点与不足?5.质粒如何维持在细胞中的稳定？主要参考资料:1.吴乃虎主编. 基因工程原理(第二版) .北京:科学出版社,2002.2.陆德如,陈永青主???．基因工程.化学工业出版社,20023.马建岗主编.基因工程学原理. 西安:西安交通大学出版社,2001 4. [美] 本杰明?卢因编著.基因Ⅷ.北京:科学出版社,2007.; 要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因） 通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工 具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具 就叫做载体（vector）。 载体: 能与外源DNA片断结合并将之传递到受体细胞而使之 复制表达的传递者。包括质粒、噬菌体、粘粒载体、 病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。 载体的功能：1、 运送外源基因高效转入受体细胞； 2、 为外源基因提供复制能力或整合能力； 3、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。 ;基因工程中的载体应具有如下一些特性: 1、能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在其DNA中插入外源基因后，仍然保持着稳定的复制状态和遗传特性。 2、在其DNA序列中，具有适当的限制性内切酶位点(最好是单一酶切位点)，这些位点位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载 体自身DNA的复制。 3、具有能够观察的表型特征(有报告墓因)，在插??外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。即容易将带有外源DNA的重组体与不带外源DNA的载体区别开来。 4、具有较高的拷贝数，便于载体的制备。 5、易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。 6、在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。 7、载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段。;第一节 质粒载体 一、质粒的基本特性 质粒(plasmid)：是 独立于许多细菌及某些 真核细胞染色体外共价 闭合环状的DNA分子， 能独立复制的最小遗传 单位，大小在1—200kb 之间。和病毒不同，它们 没有衣壳蛋白（裸DNA）。 ; 绝大多数质粒DNA是双链环形，它具有3种不同的构型: 当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时,称之为共 价闭合环形DNA(cccDNA)这样的 DNA通常呈现超螺旋的SC构型(c); 如果两条多核苷酸链中只有一条保 持着完整的环形结构，另一条链出 现有一至数个缺口时，称之为开环 DNA(ocDNA)，此即OC构型(b);若 质粒DNA经过适当的限制性核酸内 切酶切割之后，发生双链断裂而形 成线性DNA(IDNA)，通称L构型(a) 。;质粒与宿主细胞的关系 （1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居” 宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响， 宿主离开质粒照样的生存下去。 （2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶 和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。 （3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿 主细胞的补偿（“交房租”）。 （4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或 酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关 的，如抗生素抗性基因。;质粒发现和研究意义 1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的一块重要基石。 2）实践意义 是基因工程的重要载体，能把外源基因（目的基因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。 ①质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到外都是。②作为基因工程载体的3个特点： A.都能独立自主的复制； B.都能便利的加以检测（抗生素抗性）； C.都能容易引进宿