口腔中的细菌分离实验报告.docx

口腔中的细菌分离实验报告 　　微生物分离实验报告　　实验仪器及材料　　土样：18号土样　　试剂及培养基　　培养基：果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分离培养基；几丁质酶划线培养基；细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水培养基　　a)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、　　95%乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等　　仪器　　锥形瓶、培养皿、试管、移液管、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布等　　细菌的筛选，分离纯化及鉴定　　细菌的筛选　　土样处理　　配制生理盐水：在烧杯中配置％的生理盐水，用移液管各移取9ml于五支洁净试管，再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧瓶，并放入少许玻璃珠，包好灭菌；　　加土样：冷却后准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中，充分震荡摇匀，然后放在30℃恒温培养箱中静置15min。　　果胶酶菌种筛选　　梯度稀释：用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管　　中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3两种稀释度的土壤溶液；　　涂布：配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，分别写上10-1、10-3两种稀释度字样，每稀释度标记三皿，然后用无菌吸管分别由10-3、10-1两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置，每皿准确放入，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；　　培养：将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；　　果胶酶透明圈平板检测：取10-1涂布平皿，用％的刚果红染色15-20min后，倒掉刚果红，用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈，则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力；　　菌落描述：取此菌进行菌落形态描述，就菌落的大小，颜色，干湿，边缘，表面分别进行阐述并详细记录；　　细菌的分离纯化　　划线分离：制备果胶酶划线培养基，灭菌后　　倒平板，挑取具有水解圈的菌种，第一次划线分　　离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二　　次划线分离，划线分离的具体方法是：先在平皿　　上划定区域，然后将接种针在火焰上进行灭菌操　　作，取含菌种的培养皿，在火焰上方打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。操作完毕后对接种针进行灭菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种针冷却后从1区引线到2区，再如图所示划线，划完后引线到3区，同上进行划线，划线完毕后盖盖平放；　　纯种保藏：再配制一份普通细菌培养基，分装试管后灭菌，制得斜面，将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定。　　a)纯种果胶酶水解能力的测定　　配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，将分离纯化的细菌点种于平板上，在30℃培养箱中培养1～2天，取培养后的平皿用％的刚果红染色15-20min后，倒掉刚果红，用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈，测量并记录透明圈的大小　　b)简单染色步骤　　i.涂片　　取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；　　ii.干燥与固定　　涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；　　iii.染色　　将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色　　iv.水洗　　倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止；　　v.干燥　　用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；　　vi.镜检　　将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。　　c)革兰氏染色步骤　　i.涂片　　先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域，在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水。分别取四种活跃生长期菌种按常规方法涂片，用酒精灯按照简单染色中所述　　干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定。　　ii.初染　　滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂