分子克隆工具酶1课件.pptVIP

从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： 　　① T7基因5编码的大亚基： 　　　有5’?3’聚合酶和3’?5’外切酶活性。 　　② 大肠杆菌编码的小亚基： 　　　增加大亚基对模板的亲和性。 2.3.4 T7-DNA聚合酶 ① 持续合成能力强 一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。 ② 3’?5’外切酶活性高 单链和双链都能降解。 ③ 不受DNA二级结构的影响 其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍。 T7 DNA聚合酶的特点 ② 进行末端标记 ① 以大分子量DNA为模板的合成 如M13 ③ 补平隐蔽末端 3’末端标记。 与T4 DNA聚合酶相同。 合成补平3’隐蔽末端； 水解修平3’突出末端。 用　途 T7DNA聚合酶的化学修饰 去除3’?5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。 修饰后的T7 DNA聚合酶的用途 ① DNA测序双脱氧法。 ② 标记DNA 3’隐蔽末端 ③ 更有效地补平末端 修饰后的T7 DNA聚合酶 基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链 反转录酶 Mg2+ dNTP 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTTTT 3’cDNA 2.3.5 反转录酶 限制酶识别序列与DNA的来源无关，不具有种的特异性，对不同的DNA普遍适用。 识别序列的长短涉及对DNA分子切割的频率，可从理论上推导酶切DNA片段的大小。 (3) Ⅱ型限制酶的识别序列与DNA的切割 限制酶识别序列的相邻序列（长度要求）效应。大多数限制酶对只含识别序列的寡核苷酸也不具催化活性的。 限制酶的偏爱现象。限制酶对识别序列两侧的核苷酸的组成有关。（对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率） 限制酶的星星活性。指某些限制酶在不适的环境中其识别序列发生改变（切割与识别序列相似的序列）的现象。 (1) 底物DNA样品的纯度： 　蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、NaCl等。 　①加大酶的用量 　②加大反应总体积（稀释） 　③延长反应时间 2.1.4 影响限制性核酸内切酶活性的因素 当DNA样品确定后，为完全切割此DNA，酶的用量视酶的催化活性而定。 酶活力单位：在最佳反应条件下反应 1 h，完全水解 1 mg 标准λDNA所需的酶量定为1U。 修饰体系组成部分，强烈影响酶的活性。 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基。 受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影响。 E.coli的dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基。 受其影响的酶有EcoR II等。 (2) DNA样品的甲基化程度 　不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37℃，少数要求40℃～65℃。 酶 最适温度℃ 酶 最适温度℃ Apa I Bcl I Mae II Taq I Apy I 30 50 50 65 30 BstE II Mae III Ban I Mae I Sma I 60 55 50 45 25 (3) 酶切消化反应的温度 缓冲液组分包括：氯化镁、氯化钠或氯化钾、β-巯基乙醇或DTT（二巯基苏糖醇）、BSA（牛血清白蛋白）、Tris-HCl等。 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些限制酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象。 每种酶只有在最适的反应缓冲液中才具有最强的催化活性。 (4) 核酸内切酶的缓冲液性质 大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件 II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 0～50 mM 低盐酶；100 mM 中盐酶；150 mM 高盐酶 MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定； 试剂 条件 试剂 条件 Tris-HCl 50 mM pH 7.5 DTT 1 mM MgCl2 10 mM Volume 20-100 μl NaCl 0-150 mM T t 37℃ 1-1.5 h 　对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 　使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解；低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切；一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。 Ⅱ 型核酸内切酶的多酶联合酶解 修复双链DNA