小麦种子萌发早期淀粉降解关键酶活性及基因表达量研究.doc

小麦种子萌发早期淀粉降解关键酶活性及基因表达量 研究 摘要：为研究小麦种子萌发早期淀粉降解关键 酶活性及其基因表达量变化，以山农17为试验材料, 测定了不同温度条件下萌发的小麦种子中的淀粉、可 溶性糖含量及相关酶（淀粉酶和淀粉磷酸化酶）活性， 并采用实时荧光定量PCR技术测定各酶相关基因相对 表达量。结果显示,不同温度条件下萌发的小麦种子， 淀粉含量随萌发进程以不同的速率呈下降趋势，可溶 性糖含量呈先下降后上升趋势，a-淀粉酶、淀粉磷酸 化酶活性和呼吸速率整体呈上升趋势，以上各指标均 在露白前后有明显的变化；B-淀粉酶呈现双峰变化趋 势，且一直保持较高活性；a?淀粉酶和淀粉磷酸化酶 基因的相对表达量均呈上升趋势，且与酶活性呈极显 著相关。以上结果表明，在小麦种子萌发早期，温度 能强烈影响萌发过程中淀粉降解关键酶基因的表达量; a -淀粉酶和淀粉磷酸化酶在种子置床初期即可被检 测到活性，且受其编码基因的调控作用显著，在种子 萌发过程中具有重要作用。 关键词：淀粉代谢；淀粉酶；淀粉磷酸化酶；荧 光定量PCR；基因表达 中图分类号：S512.1+1文献标识号：A文章编号: 1001-4942 (2014) 09-0039-07 萌发是植物生长发育的前提，关系到作物后续生 长，乃至最终产量［1］。影响种子正常萌发的因素很多, 包括内部生理条件和外部环境条件，其中，温度强烈 影响萌发种子内部酶活性和物质代谢，进而影响发芽 率和萌发速率［2］。 目前，对种子萌发代谢的研究已从传统的生理生 化水平深入到基因组及蛋白质组水平⑶。但诸类深层 次的研究大多集中于大麦、番茄以及模式植物拟南芥, 且主要针对种子萌发后期的代谢变化，对萌发初期的 研究甚少［4, 5］0 Weitbrecht等⑹指出对种子萌发早期 (介于干燥种子和胚突破种皮后幼苗建成阶段之间) 内部代谢事件进行研究，对于完善种子萌发的机理具 有重要意义。 淀粉降解是小麦种子萌发过程中主要的物质代谢， 其代谢产物为种子萌发提供必需的养料和能量⑺。关 于淀粉降解及其相关酶的研究已有诸多报道⑻。然而, 在基因水平层面的研究多集中在种子发育过程中的淀 粉合成部分［9, 10］,对萌发过程中淀粉降解关键酶基 因表达量的研究不多。因此，本研究以当地小麦品种 山农17为试验材料，测定了不同温度条件下萌发早期 （介于干燥种子和胚突破种皮后幼苗建成阶段之间） 淀粉和可溶性糖含量、淀粉降解关键酶活性及其基因 相对表达量变化，旨在探究种子萌发早期淀粉降解的 酶学变化和基因转录调节变化，以期为进一步阐明小 麦种子萌发机理提供基础数据。 1材料与方法 1.1材料与设计 以小麦品种山农17为试验材料，2012年收获于 山东农业大学试验站。 发芽共设置3个温度处理（最适温度20°C、高温 30°C.低温10°C）o取样时间分布在萌发前、露白至 发芽三个阶段。具体取样时间：30°C下萌发的种子每 隔4h取样；20°C和10°C条件下萌发的种子每隔8 h 取样，直到发芽结束（胚芽长度为种子一半）时停止 取样。此外，20°C和10°C条件下，在露白时各增加一 次取样（20°C、12 h, 10°C 40h）o发芽前将种子含 水量调整到12.5% （以减少种子本身对结果造成的差 异），用5%H2O2消毒2?3 min,再用去离子水冲洗5? 6遍后选取100粒籽粒饱满、大小均一的种子，整齐 的摆放到发芽盒，放入培养箱培养，每天适量补水并 按时取样。重复3次。用于RNA提取的材料保存于液氮中，用于酶活性测定的材料液氮速冻后放入?20°C冰 箱中备用 1.2试验方法 1.2.1测定方法淀粉含量参考双波长法测定［□］； B ■淀粉酶及总淀粉酶活性参考3, 5■二硝基水杨酸法 测定［13］；淀粉磷酸化酶活性采用无机磷释放定量分 析法测定［14］。 1.2.2小麦籽粒总RNA的提取、质量检测及反转录 总RNA的提取、质量检测参考李浩等的方法［15］oCDNA 合成按照宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）反 转录试剂盒说明书进行，反转录后的cDNA保存于?20°C 冰箱备用0 1.2.3荧光定量PCR用于目标基因表达分析的引物 序列（表2）来源于参考文献或利用Primer 6软件设 计，通过NCBI进行Blast同源比对后由上海生工生物 工程有限公司合成。各酶基因表达量分析采用实时荧 光定量PCR，反应采用宝生物试剂盒（SYBR Premix Ex TaqTM）,反应体系为20 U L。 2结果与分析 2.1总RNA纯度及完整性检测 经琼脂糖凝胶电泳检测（图1）,加样孔中无明显 亮带，表明无蛋白质污染。总RNA的28S rRNA和18S rRNA条带清晰，且条带亮度比约为2 : 1, 5S条带较 弱，说明总RNA的完整性较好，无明