PCR扩增及克隆基因-Bio-protocol.PDFVIP

/e1010202 DOI:10.21769/BioProtoc.1010202 PCR 扩增及克隆基因 PCR Amplification and Gene Cloning 徐远涛，徐强* 园艺植物生物学教育部重点实验室，园艺林学学院，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：xuqiang@ 引用格式 ：徐远涛，徐强 . (2018). PCR 扩增及克隆基因 . Bio-101 e1010202. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010202. How to cite: Xu, Y. T. and Xu, Q. (2018). PCR amplification and gene cloning. Bio- 101 e1010202. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010202. (in Chinese) 实验原理：PCR (polymerase chain reaction) 的原理是在模板DNA、引物和4 种脱氧 核糖核苷酸 (dNTP) 存在的条件下，依赖于DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。两个引 物分别位于靶序列的两端，同两条模板的3端互补，由此限定扩增片段。PCR 反应由一 系列的变性-退火-延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA 变性解链，然后在较低 的温度下同过量的引物退火，再在适中的温度下由DNA 聚合酶催化进行延伸。由于每 一循环的产物都可作为下一循环反应的模板，因此扩增产物的量呈指数级增加。PCR 之 后通过胶回收得到纯化的目的基因片段，连接到克隆载体质粒中，转入大肠杆菌细胞， 质粒随着大肠杆菌细胞的快速繁殖也快速复制，富集大肠杆菌细胞抽提质粒即可得到大 量的克隆质粒。 实验目的：通过 PCR 扩增目的基因片段，并利用大肠杆菌转化获得单克隆质粒，用于 测序、基因序列分析、特异探针构建及后续表达载体构建。 关键词：PCR，大肠杆菌，转化，克隆，质粒 材料与试剂 1. 各种型号枪头 2. 离心管 3. PCR 用八连管 4. 矿物油 5. 封口膜 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010202 DOI:10.21769/BioProtoc.1010202 6. 玻璃涂布棒 7. DNA 模板 (或cDNA) 8. DNA 聚合酶 (Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase, 诺唯赞, catalog number: P505-d1) 9. dNTP 10. 引物 11. 双蒸水 12. Gene Ruler (Thermo Scientific Gene Ruler 1 kb DNA ladder, catalog number: SM0311) 13. 琼脂糖 14. 核酸染料 (GelRed) 15. 冰醋酸 16. NaCl 17. 胰蛋白胨 18. 酵母提取物 19. 琼脂粉 20. 琼脂糖胶纯化试剂盒 (Gel Extraction Kit, OMEGA, catalog number: D2500-02) 21. 克隆质粒 (Zero-Background P-Topo-Blunt Simple Cloning Kit, Aidlab, catalog number: CV17) 22. Trans 5α E. coli 感受态细胞 (全式金生物科技有限公司) 23. 质粒提取试剂盒 (AxyPrep Plasmid Kit, AXYGEN, catalog number: 21515KA1) 24. TAE 缓冲液 (见溶液配方) 25. 氨苄霉素 (见溶液配方) 26. LB 培养基 (见溶液配方) 仪器设备 1. 涡旋仪 2. 小离心机 3. PCR 仪 4. 电泳仪 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 2