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分子克隆技术在热带作物中的应用 摘要：分子克隆技术在热带作物中主要用于建立基因文库、分离高产和抗性基因、基因重组选择适当受体和载体以及异源基因的导入等。在热带作物品种鉴定、资源保护以及繁殖育种中起到了重要的作用。 关键词：分子克隆；热带作物 分子克隆技术也称为基因克隆技术,包括把来自不同生物的基因同有与自主复制能力的载体DNA在体外人工连接,构建成新的重组DNA,然后送入受体生物中去表达,从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。热带作物是热带地区的栽培植物，是适于热带地区栽培的各类经济作物的总称。主要包括橡胶；油料作物：油棕、椰子、腰果；香料作物：胡椒、香茅、香根、罗勒；纤维作物：龙舌兰科麻类、番麻、蕉麻、爪哇木棉；饮料作物：咖啡、可可；药材：砂仁、巴戟、槟榔、三七；热带水果：香蕉、荔枝、龙眼、菠萝、芒果、油梨、番瓜、番石榴等。 一、分子克隆技术 分子克隆技术是七十年代初发展起来的新技术，在十年时间里已经得到了广泛地应用。它不仅对分子生物学、遗传学、细胞学等学科研究起了很大的推动作用，而且在工业、农业和医学等实际部门也将作出应有的贡献。分子克隆技术涉及面很广，包括限制性内切酶的应用，基因分离，载体组建，DNA片段连接，细胞转化，重组体的筛选和鉴定，基因表达和物质的生产等方面[1]。 二、热带作物的发展现状 本世纪以来,世界热带农业发展势头强劲,热带作物初级产品的产量从2000年的4. 85亿吨上升至2006年的6. 12亿吨, 5年间增长了26%。在世界热带经济作物中,产量增长幅度比较大的作物有油棕果、天然橡胶和木薯, 5年分别增长了45%、39%和27%。近年,热带水果产量均有不同程度的增长, 2006年香蕉、芒果、菠萝、油梨和番木瓜的产量比2000年分别增加了10%、16%、21%、24%和12%。[2]。 随着热作产业的快速稳定发展，热带作物资源的不可替代性、地域的不可替代性、产品的不可替代性及其在中国经济发展和国家建设中所具有的地位日益重要。科学收集和保存热带作物资源，以使其能够得到合理的开发利用已成为确保热带作物产业持续稳定健康发展的关键环节[3]。 三、分子克隆技术在热带作物中的应用 分子克隆技术在热带作物中主要用于建立基因文库、分离高产和抗性基因、基因重组选择适当受体和载体以及异源基因的导入等。在热带作物品种鉴定、资源保护以及繁殖育种中起到了重要的作用。 橡胶 橡胶分为天然橡胶和合成橡胶。天然橡胶主要来源于三叶橡胶树，巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)因胶乳产量高、质量好、易于获取而具有商业开发价值，成为世界上天然橡胶的主要来源。由于巴西橡胶树是多年生乔木，常规育种周期长，选育种受到很大的限制。不断发展的基因工程技术解决了传统育种中不能突破的问题，其优点在于可有目的地改变植物的某一性状而不影响其他性状，并缩短育种周期。随着转基因技术的日臻完善，目前已经获得了许多转基因植物，但是橡胶树的基因转化仍存在很大困难。在1994年Arokiaraj等利用基因枪法获得了第一株转基因橡胶植株，随后，在1998年他们又尝试用农杆菌介导法转化橡胶愈伤组织,但是转化效率很低。2000年Montoro等人研究了Ca在橡胶的农杆菌转化中的作用，但未得到转基因植株[4,5,6]。2006年王颖[7]等以GUS基因为报告基因，NPTⅡ(新霉素磷酸转移酶,Neomycinphosphotransferase)基因为筛选标记基因，用基因枪轰击橡胶愈伤组织进行转化实验，经过质粒DNA提取、愈伤组织诱导、基因枪转化、GUS组织染色和PCR扩增鉴定，初步确定GAI基因已经整合到橡胶基因组中。 槟榔 槟榔（Areca cathecu L.）是中国四大南药（槟榔、砂仁、益智、巴戟）之首，药用价值很高。槟榔产业是海南省热带作物产业中仅次于天然橡胶的第二大支柱产业。自1981年，在屯昌发现槟榔黄化病以来，琼海、陵水、万宁、三亚等地的槟榔种植区相继开始发现黄化病的危害，发生情况逐年严重，发生地点和面积也不断扩大，大量槟榔植株黄化死亡，严重影响了海南槟榔产业的健康发展[7,8]。俞浩等[9]调查认为万宁、屯昌的槟榔黄化病是由缺钾引起。金开璇等[10]通过电镜观察发现海南槟榔黄化病病株的输导组织内存在类细菌（Bacteria-like Organisms，简称BLO）与类菌原体（Mycoplasma like organisms，MLO）菌体，初步认为海南槟榔黄化病是由BLO与MLO复合侵染引起的。在此之后，罗大全等[11]通过电镜观察、抗菌素注射诊断、PCR技术检测，证实海南槟榔黄化病是由植原体（原称类菌原体）引起，但未见从分子水平等方面对其分类地位研究的报道。车海彦[12]等利用植原体16S rDNA通用引物对海南感染黄化病的槟榔花苞总DN