成功定量研究的经验及体会.pdf

成功定量分析的经验与体会 基础应用培训 查阅文献： • 了解被分析物的基本信息，分子量、溶剂、分子极性等 • 了解被分析体系的色谱分析条件：等度/梯度分离、色谱 柱与流动相类型等 • 了解化合物提取方法 • 溶剂包括水的纯度，最好色谱纯以上 • 新的色谱柱可能要先冲洗很长时间才能干净,某些样品非 常容易吸附在进样阀和管路中，用溶剂清洗 • 质谱仪须校准，预热时间要足够长，气流的稳定也很重 要，液N2阀开度要注意，达到稳定程度 02/20/2010 2010 ASC 2 基础应用培训 MS条件优化——先定性后定量 • 首先，确定离子化方式： ESI or APCI，Pos or Neg • 标准溶液进样，Q1 Scan 察看存在哪些离子，要能够看到待测的母离 子，应明显比周围的噪声离子高，通过改变DP，观察离子的增减， 若为Pos方式，看M+1，M+18，M+23等等，初步判断分子离子，如 看不到则可能是浓度太低或离子化方式不合适，或选择的溶剂体系不 合适 • 母离子选M+H，或M-H最好，但有时只有M+NH4 ，M+Na等，这样 CAD能量可能需要高些，选择[M+H]+ ，还是+NH ，+Na等，要由化 4 合物决定。加合离子若稳定，则可用，不稳定则可能需换流动相，但 +H通常好些，所需碰撞能量低，灵敏度高；如含Cl可选择2个母离子 峰 02/20/2010 2010 ASC 3 基础应用培训 MS条件优化——先定性后定量（续） • 再根据上一步确定的母离子进行Product Scan，确保所有碎片离子都 来自待测化合物，而不是溶液中的杂质，找出较强的碎片离子信息。 还可改变CE，从中选定MRM需要测定的一对或更多离子对，为最后 LC-MS/MS联用做准备 • 做Product Scan时，注意小数点后的位数，MRM输入要准，灵敏度 才高 • 先多选几个离子对，待出现基质干扰时可换，最后根据法规要求确定 离子对数目 • MRM方式优化仪器，通过优化仪器参数，使MRM灵敏度最高。只检 测一对离子时根据TIC 的强度来确定仪器参数，一次优化多对离子 时，要根据每对离子的XIC强度来分别确定仪器参数 02/20/2010 2010 ASC 4 基础应用培训 MS条件优化——先定性后定量（续） • 先用注射泵优化Compound项下的参数，如DP、 CE及CXP等，再接通LC，用FIA优化其他参数如 温度，气流和IS电压及离子源位置，或接一个三 通，样品仍由注射泵进入离子源，同时LC保持需 要的流量，然后进行MRM测定。 • 分辨率的选择：当样品较纯，Q3可选Low，提高 灵敏度，若选Low后本底噪声太高则意义不大。 02/20/2010 2010 ASC 5 基础应用培训 LC条件优化 • 色谱柱长度可根据分离的要求而定，定量分析在能有效排 除离子抑制干扰情况下尽量短，以提高效率 • 注意流速大小应与色谱柱内径大小相匹配 • 不同牌号色谱柱，效果很可能不同 • pH的影响：正离子方式pH要低些，负离子方式pH要高 些，除对离子化有影响外，还影响LC 的峰形，以至定量 误差。 • 流动相添加微量的乙酸铵可以增加体系离子强度，对大部 分的测定有利，浓度一般控制在2～5mmol/L 02/20/2010 2010 ASC 6 基础应用培训 LC条件优化（续） • 用流动相配的标样，初步优化确定LC条件是否合适 • 标准品工作液现配现做，尤其是较低浓度，时间长了可能因吸附分解 等降低 • 进样