crispr cs9进行全基因组的筛选.doc

Human CRISPR Knockout Pooled Library (Brunello) lentiCas9-Blast质粒的基本信息： HYPERLINK /pooled-library/broadgpp-human-knockout-brunello/ /pooled-library/broadgpp-human-knockout-brunello/ 由于cas9自待的抗性基因是我们不需要，在抗性基因两边突变出酶切位点，酶切掉原本的抗性基因。换成另一种。 lentiCas9-Blast质粒购买来时是以细菌的形式存在的,先需要扩大培养。 试剂盒提取质粒，并测定浓度。 慢病毒包装质粒 转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293T细胞，调整细胞为7*105在5ml的DMEM培养基中。37 ℃ 、 5% CO2 培养箱内培养。待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。 转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。 向离心管中加入质粒DNA和等体积的Opti-MEM，混匀，调整总体积为 2.5 ml，在室温下温育5分钟。 将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100 μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4 ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。 把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。 混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。 DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37 ℃, 5% CO2 细胞培养箱中培养。 培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。 每瓶细胞中加入含10% 血清的细胞培养基25 ml，于37 ℃ 、 5% CO2 培养箱内继续培养48小时。 收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。 于4 ℃，4000 g 离心10 min，除去细胞碎片。 以0.45 μm滤器过滤上清液于15ml 离心管中。 慢病毒转染细胞 参考网址：/protocols/generating-stable-cell-lines/ 1. 取六孔板铺50000个细胞，?37°C, 5% CO?2 培养，待细胞长到70%，换含有8ug/ml?polybrene的培养基培养。 2. 慢病毒悬液用含有10ug/ml的DMEM培养基稀释。 3. 六孔板中每个空加一种浓度的病毒稀释液，每空0.5ml。 4. 孵育48~72小时。 5. 换成含有适宜浓度的抗生素的培养基培养1.5ml，筛选出转染成功的细胞。抗生素浓度的摸索:用培养基稀释抗生素为1ug/ml、2ug/ml、3 ug/ml、4 ug/ml、5 ug/ml、6 ug/ml、7 ug/ml、8 ug/ml、9 ug/ml、10 ug/ml，并用稀释后的浓度培养细胞，3~5天内使所有细胞死亡的最低浓度可用于筛选细胞。 6. 持续加药筛选直到细胞不再大量，并能稳定表达Cas9。一般筛选需要1~2个星期。 7. 在转导sgRNA文库前2~7天改用正常培养基培养。 （或者先测定MOI值后，根据MOI加病毒的量，操作可参照sgRNA的转导） 检测病毒转染的结果 试剂盒提取质粒 PCR扩增（/cms/filer_public/61/16/611619f4-0926-4a07-b5c7-e286a8ecf7f5/broadgpp-sequencing-protocol.pdf）。 引物： Forward Primer: dCas9-F2 CCAAAGAGGTGCTGGACGReverse Primer: Blast-R GCTCTTTCAATGAGGGTGGA 2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用试剂盒纯化PCR产物 通过免疫印迹扩增，收集，裂解并测试Cas9表达的细胞群。 lentiGuide-Puro骨架基本信息 SgRNA library的设计: 在基因芯片上合成核苷酸，分离出来后，进行PCR扩增。 把设计好的sgRNA整合到质粒上： /data/plasmids/52/52963/52963-attachment_IPB7ZL_hJcbm.pdf SgRNA文库的构建 lentiGuide-Puro载体可以使用BsmBI和一对退火的寡核苷酸可以把sgRNA克隆到骨架中。 首先把5ug的lentiviralCRISPR 质粒用BsmBI混合37度，酶切30min。 试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit）纯化酶切的质粒，