原核表达实验1.ppt

操作步骤1 蛋白质电泳 取-20℃保存的纯化好的蛋白样品（洗脱收集的上清）50μl，用1xPBS十到五十倍稀释；取50μl稀释液，加入25μl 3×SDS上样缓冲液，沸水水浴5分钟； 各样品在室温以10000rpm离心1分钟，取上清10-20ul SDS蛋白电泳。 操作步骤2 蛋白质的半干式电转移 （戴手套操作） 将蛋白胶的积层胶切除(当胶上的样品较少时，不含目的蛋白的胶应都切除，使剩下的胶块尽可能小)，然后浸入Towbin buffer中平衡； 预先准备专用的滤片2张(或18张滤纸)和1张硝酸纤维素滤膜，其大小都应与凝胶大小吻合；用铅笔在滤膜一角做好标记； 将 1张滤片(或9张滤纸)在Towbin buffer中浸润后放置在电极上(如用9张滤纸则应逐张叠放整齐) ，用玻璃棒挤出所有气泡。（具体摆放顺序见下图） 于Towbin buffer中浸润硝酸纤维素滤膜，然后置于滤纸/片上，排出气泡； 然后将平衡好的蛋白胶置于硝酸纤维素滤膜上，排出气泡； 再依次将另外9张滤纸(1张滤片)在Towbin buffer中浸润后放置在蛋白胶上。 加上阴极电板，25V电压转移40分钟。 转移完成后，取出NC膜，在TBS漂洗5min，置入丽春红染液中染色，出现蛋白条带后，用自来水漂洗1min，用铅笔标记处蛋白质Marker的位置，然后加入TBS漂洗至颜色消失； 操作步骤3 膜的封闭 用含有5％脱脂牛奶的TBS-T封闭NC膜（含有0.1%吐温20的1倍的TBS），在室温条件下孵育1至2小时(推荐在4℃条件下孵育过夜)； 用TBS-T漂洗：15分钟，1次；5分钟，2次。 在室温条件下，将NC膜转入含有1％脱脂牛奶和合适稀释度（1:1500）的一抗的TBS-T溶液中，孵育1至2小时； 用TBS-T漂洗：15分钟，1次；5分钟，3次。 操作步骤5 二抗进行杂交 在室温条件下，将NC膜转入含有1％脱脂牛奶和合适稀释度的二抗的TBS-T溶液中(1:5000)，孵育1小时； 用TBS-T漂洗：15分钟，1次；5分钟，3次。 用TBS漂洗：5分钟，3次 Towbin Buffer： 25mM Tris pH8.3 192mM glycine 20% methanol 10×TBS缓冲溶液（1L） Tris-Base 24.2g ， NaCl 80g ，pH7.6 培养基 LB培养基 胰蛋白胨（TRYPTONE）10g，酵母浸出物5g，氯化钠10g，调pH至7.0，用蒸馏水定容至1L。 YPD培养基 蛋白胨（Peptone）20g，酵母浸出物10g，葡萄糖20g，调节pH至6.5，用蒸馏水定容至1L。 BMMY 蛋白胨（ Peptone ）20g，酵母浸出物10g，酵母氮碱3.4g，硫酸铵10g，用pH7.0的0.1mol/L磷酸钾缓冲液定容至1L。 第十一组，第十二组，第十三组，第十四组 PA瓶150个，50ml离心管100个，各式枪头30盒，洗好包好，灭菌 250ml三角瓶200个洗好 500ml三角瓶50个，试剂瓶20个洗好 第十五组 配置10% SDS（w/v）500 ml Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 配成5×贮存液备用，在900ml去离子水中溶解 15.1gTris碱和94g甘氨酸， 然后加入50ml 10%（w/v）的电泳级SDS贮存液， 用去离子水补至1000ml。 脱色液Gel Destaining Buffer 4L 甲醇 100 ml，乙酸100 ml，加水至1000 ml * 实验一：大肠杆菌表达载体的构建及融合蛋白诱导表达 生命科学技术学院 张忠明 朱辉 袁松丽 2010年6月 黑曲霉的优化培养 总DNA或RNA的抽提 PCR或RT-PCR扩增xynB基因 目的基因的TA克隆 质粒pMD-xylB EcoRI+XhoI双酶切 凝胶回收试剂盒回收目的片断xynB 乙醇沉淀回收线性化片断 大肠杆菌表达载体pET-28(a)+ 酶连 酶连产物转化E.coli DH5? 挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证) 28S 18S 重组表达质粒转化E.coli BL21 挑取重组子, 用菌落PCR方法验证 IPTG诱导促使目的大量蛋白表达 细胞破碎及蛋白抽提 目标蛋白的纯化 蛋白质浓度测定--Bradford法 目标蛋白的鉴定—Western biotting 融合蛋白诱导表达流程图 XylB CK 100mM IPTG 1ml LB+Kan 1-I 1+I 2+I 3+I