醋酸纤维薄电泳法分离血清蛋白.docVIP

醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白 目的和要求 掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理及操作方法 原理 带电质点在电场中向着反向电极移动的现象称为电泳，其移动方向及速度取决于本身所带电荷的性质和数量、电场强度以及溶液pH等因素。蛋白质分子在溶液中的电泳是因其分子具有一些游离的可解离基团如-COOH、-NH2、-OH等，因而在某种pH值溶液中蛋白质分子带有一定的电荷。混合蛋白样品中由于各蛋白质的等电点不同，在同一pH溶液中所带的电荷性质及电荷数目不同，因此在电场中各种蛋白质泳动的方向和速度也不同，从而使蛋白质混合样品得以分离。 血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白等，其氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状等均有所不同。由下表可见，血清中5种蛋白质的等电点大多低于pH7.0，在pH8.6的缓冲液中都电离成负离子(羧基解离)，故在电场中均向阳极移动。 蛋白质种类 等电点(pI) 相对分子量(Mr) 清/白蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85~7.50 69 000 200 000 300 000 90 000~150 000 156 000~300 000 在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将各蛋白质区带剪下，分别用0.4 mol/L NaOH溶液浸洗下来，通过比色法或将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，以测定特定电泳区带的蛋白质相对含量。 本实验采用的醋酸纤维薄膜电泳法是以醋酸纤维薄膜为支持物。醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化后形成的纤维醋酸酯，将其溶于有机溶剂(如丙酮、氯仿、乙酸乙酯等)后于聚乙烯材料上涂成均匀的薄膜，待溶剂蒸发后即可。该膜具有均一的泡沫状结构，有强渗透性、其厚度约为120 μm。 醋酸纤维薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点，目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白和同工酶的分离及测定。 操作步骤 ㈠ 准备 醋酸纤维薄膜的润湿和选择：将薄膜裁成8×2cm状，使其漂在缓冲液液面上(若迅速湿润，整条薄膜一致而无白点，则表明薄膜质地均匀，可用于电泳实验)，然后用竹夹/镊子轻轻地将薄膜完全浸入缓冲液中，待薄膜完全浸透后使用(约0.5h)。 制作电桥：将电泳缓冲液倒入电泳槽两边并用虹吸管平衡两边液面。根据电泳槽的纵向尺寸，剪裁尺寸合适的滤纸条。取四层附着在电泳槽的支架上，使其一端与支架的前沿对齐，另一端则浸入电极槽的缓冲液内。然后用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。它们的作用是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。 ㈡ 点样 取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸之间吸去多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝上)，用点样器蘸取适量血清(约2~3 μl)，再“印”在薄膜的点样区(距薄膜一端1.5 cm处)。血清应均匀分布，形成具有一定宽度、粗细匀称的直线。点样切忌过量，可事先在滤纸上练习以 ㈢ 电泳 将点好样的薄膜(无光泽面朝下)两端紧贴在支架的滤纸桥上(加血清端靠负极)，中部保持悬空平直。先平衡10 min，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后通电。打开电源开关，调节电流为0.4~0.6 mA (薄膜每厘米宽)，电压为每厘米长10~12V。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高偏低。待电泳区带展开约3~5 cm时，关闭电源，一般通电时间为60 min ㈣ 染色 电泳结束后，关闭电源，立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5~10 min。然后用漂洗液漂洗至背景无色(约3~5次)。再浸于蒸馏水中或用滤纸吸干。 ㈤ 结果判断 一般经染色漂洗后，薄膜上可呈现5条区带，由正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。 试剂和器材 试剂 1. 新鲜血清(制备时要无溶血现象) 2. 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.075mol/L，离子强度0.06)：称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于少量蒸馏水后定容至1,000mL。 3. 染色液：称取氨基黑10B 0.5g，加入蒸馏水40 mL，甲醇50 mL和冰醋酸10 mL，混匀，贮存于试剂瓶中。 4. 漂洗液：取95%乙醇45 mL，冰醋酸5 mL和蒸馏水50 mL，混匀。 器材 醋酸纤维薄膜：市售的电泳用醋酸纤维薄膜 培养皿(直径9~10 点样器/血色素吸管 直尺和铅笔 电泳仪和电泳槽 镊子 普通滤纸 试管和试管架 思考题 1. 点样为什么要在粗糙面？电泳时为什么点样面要向下放置？ 2. 如果区带