固相析出分离技术.doc

第一篇 技术篇 第三章 固相析出分离技术 第一节 概述 生物工业的最终产品许多是以固体形态出现的。通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式从溶液中沉淀析出的分离纯化技术称为固相析出技术。由于固相析出技术操作简单、成本低、浓缩倍数高，所以广泛应用于生物产品的分离纯化过程中。 固体产品可分为结晶形和无定形两种形态。在工业生产中，蔗糖、食盐、氨基酸、柠檬酸的最终产品一般都是结晶形物质；而淀粉、酶制剂、蛋白质和某些喷雾干燥获得的产品一般都是无定形物质。在固相析出过程中，析出物为晶体时称为结晶法；析出物为无定形固体时称为沉淀法。常用的沉淀法主要有盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。沉淀和结晶在本质上同属于一种过程，都是新相析出的过程。两者的区别在于构成单位(原子、分子或离子)的排列方式不同。结晶形物质构成单位的排列方式是规则的，而无定形物质构成单位的排列是不规则的。在条件变化缓慢时，溶质分子具有足够时间进行排列，有利于结晶的形成；相反，当条件变化剧烈，强迫快速析出，溶质分子来不及排列就析出，结果形成无定形沉淀。沉淀法具有浓缩与分离的双重效果，但所得的沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂。由于只有同类原子、分子或离子才能排列成晶体，所以结晶法析出的晶体纯度比较高，但结晶法只有目的物达到一定的纯度后，才能收到良好的效果。 第二节 盐析法 学习目标 1. 掌握盐析法的原理、特点及其影响因素。 2. 掌握盐析法的具体操作方法及其注意事项。 3. 能够熟练地进行盐析操作。 一、基本原理 在高浓度中性盐存在的情况下，蛋白质等生物大分子在水溶液中的溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析。盐析沉淀法简称盐析法。蛋白质，多肽、多糖和核酸等生物大分子都可以用盐析法进行分离。例如：20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀；43％饱和度的硫酸胺可以使DNA和rRNA沉淀。但盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，其突出优点是：成本低、不需特殊设备、操作简单、安全、应用范围广、对许多生物活性物质具有稳定作用。但盐析法分离的分辨率不高，一般用于生物分离纯化的初步纯化阶段。 现以蛋白质盐析为例说明盐析法的原理。在蛋白质分子表面分布着各种亲水基团，如：－COOH、－NH2、－OH，这些基团与极性水分子相互作用形成水化膜，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm大小的亲水胶体，削弱了蛋白质分子间的作用力，蛋白质分子表面的亲水基团越多，水膜越厚，蛋白质分子的溶解度也越大。同时，蛋白质分子中含有不同数目的酸性和碱性氨基酸，其肽链的两端含有不同数目的自由羧基和氨基，这些基团使蛋白质分子表面带有一定的电荷，因同种电荷相互排斥，使蛋白质分子彼此分离。所以蛋白质水溶液是一种稳定的亲水胶体溶液，蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围形成水化膜的程度，以及蛋白质分子表面所带电荷的情况决定的。向蛋白质溶液中加入中性盐，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，它会抢夺本来与蛋白质分子结合的自由水，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，高浓度的中性盐溶液中存在大量的带电荷的盐离子，它们能中和蛋白质分子表面的电荷，使蛋白质分子间的静电排斥作用减弱甚至消失，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。其机理如图3-1所示。 图 3-1 盐析机理示意图 二、盐析常用的盐类及其选择 盐析所用无机盐的挑选原则主要有以下几点：①要有较强的盐析效果。一般来说，阴离子影响盐析的效果比阳离子显著，且含高价阴离子的盐比含低价阴离子的盐盐析效果好。②要有足够大的溶解度，且溶解度受温度的影响尽可能地小。这样便于获得高浓度的盐溶液，尤其是在较低的温度下操作时，不至于造成盐结晶析出，影响盐析效果。③不影响蛋白质等生物大分子的活性。并且，最好不引入给分离或测定带来麻烦的杂质。④来源丰富，价格低廉。 盐析常用的盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、磷酸二氢钠等。实际应用中以硫酸铵最为常用，主要是因为硫酸铵有以下优点：①离子强度大，盐析能力强。②溶解度大且受温度的影响小。尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其它盐类所不具备的。由表3-1可以看出，硫酸铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类。③有稳定蛋白质结构的作用，不易使蛋白质变性。有的蛋白质在2～3mol/L的(NH4)2SO4溶液中可保存数年。④价格低廉，废液不污染环境。缺点是硫酸铵水解后变酸，在高pH下会释放出氨，腐蚀性较强。因此，盐析后要将硫酸铵 硫酸钠无腐蚀性，但低于40℃就不容易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。磷酸盐也常用于盐析，具有缓冲能力强的优点，但它们的价格较昂贵，溶解度较低，还容易与某些金属离子生成沉淀，所以也没有硫酸铵应用 表3-1 常用盐析剂在水中的溶解度