轮藻提取物抑菌作用研究.doc

PAGE PAGE 9 轮藻提取物抑菌作用研究 学生：王琪 指导教师：谢树莲 李砧 摘要 以轮藻的乙醇提取液作为抑菌剂进行抑菌试验。结果表明不连续轮藻（娘子关）的醇提液对三种模式菌均无抑制作用；拟丽藻和普生轮藻的醇提液对大肠杆菌无抑制作用，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有较明显的抑制作用，并且对金黄色葡萄球菌的抑制作用存在显著的种间和地域差异，其中以拟丽藻（晋祠）醇提液的抑菌效果最好；最低抑菌浓度分别为：拟丽藻（晋祠）和普生轮藻（晋祠）的醇提液对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为生药浓度10%；拟丽藻（晋祠）醇提液对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为生药浓度13.3%，普生轮藻（晋祠）的醇提液对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度大于生药浓度20%。 关键词 轮藻；提取物；抑菌作用；最低抑菌浓度 近年来，由于抗生剂或其他化学合成剂的滥用，使致病菌的抗药性不断增强，出现耐药性很强的变种，此外，还造成了一些严重的问题，如环境污染、生态失衡等非靶标生物目标。这就需要开发一些天然的抑菌剂[1]，而植物源杀菌剂恰因其具有选择性强、安全、易降解等优点，越来越受到国内外研究者的亲睐。植物源抑菌剂是利用某些植物里含有的某些抗菌物质或诱导产生的植物防卫素，杀死或抑制某些病原菌的生长发育。目前已报道的有139种植物，主要集中在种子植物中。从抑菌植物中分离的抑菌物质的主要结构类型有萜类、生物碱类、酯类、坩类、醇类等化合物，几乎涉及各类植物成分[2]。 轮藻属绿藻门,是大型沉水藻类植物，分为1纲、3目（直立轮藻目、右旋轮藻目、左旋轮藻目），现存仅左旋轮藻目的轮藻科，含6属，约400种,其分布遍及全球。中国也是轮藻的主要产地，记有5属、152种、39变种，在各种淡水及半咸水中都能见到，分布十分广泛 [3]。具有关报道，生长轮藻的水域中没有孑孓生长[4～5]菌体的熏烟可以驱蚊，因此，轮藻中应有一定的杀虫抑菌成分，对其抑菌性进行研究，可以作为筛选和开发药用轮藻植物资源提供资料，也可为寻找新的具有抑菌或杀菌作用的植物资源提供科学依据，其提取物还有望用于食品天然防腐剂的开发、利用等[6]。 1材料与方法 １.１材料与试剂 普生轮藻，于2006年三月采于山西晋祠；拟丽藻，于2006年三月采于山西晋祠；不连续轮藻（娘子关），于2006年四月初采于山西娘子关；普生轮藻，于2006年四月末采于山西洪洞广胜寺。烘干研碎，放于广口瓶中保存[7]。 95%乙醇，由天津市天心精细化工开发中心生产；牛肉膏，由北京奥博星生物技术责任有限公司生产；蛋白胨，由北京奥博星生物技术责任有限公司生产；琼脂，由福建泉州市泉港化工厂生产；氯化钠，由北京化工厂生产。所用试剂均为分析纯。 2供试菌种 实验菌株选用[8]：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。大肠杆菌（革兰氏阴性细菌）的数量是水源和食物被污染强度的标志，枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性细菌）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）在空气中分布较多。以上菌种均由山西大学微生物教研室提供。 1．３培养基 牛肉膏蛋白胨培养基[9]：　取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000ml，加热溶化，调pH值为7.0，分装于三角瓶中， 4主要仪器 索氏（Soxhlet）提纯器，旋转蒸发仪，超净工作台，ZDX-35B1型座式自动电热压力蒸汽灭菌器，DH4000A型电热恒温培养箱，容量瓶，三角瓶，蒸发皿，培养皿，移液管，涂布棒，酒精灯，游标卡尺，物理天平，电子天平。 １．5轮藻醇提液的制备 1.5.1 Soxhlet提取法 称取10g轮藻粉末，放入150ml Soxhlet提纯器中，按照固液质量比1：10，在圆底烧瓶中加入100ml的95%乙醇，92℃下水浴加热回流提取10-12h，到提取液颜色较浅为止，待冷凝液刚刚虹吸下去时，即可停止加热。稍冷却后，改成旋转蒸发装置，把提取液中大部分乙醇蒸出（回收），被浓缩的提取液再用容量瓶定容到50ml, 即得轮藻的醇提物。 1.5.2提取物不同浓度溶液制备 由于抑菌实验选用的是不同提取物，因此须计算为同一当量进行抑菌实验比较[10]，记1g生药溶于10ml95%乙醇中为生药浓度1：1的溶液。由此，1.5.1中获得的醇提物的浓度为1：5。取1∶5浓度的溶液于小玻璃瓶中,用梯度浓度配比法配成浓度分别为1：6、1：7.5、1：8、1：10、1：12、1：20的各提取物的醇溶液。 1. 6供试菌悬液的制备 将供试的各种菌种进行斜面活化[11]，取一定量已活化的供试菌于装有9mL 液体培养基中培养12h，再取0.5ml含供试菌的液体培养基放入19.5ml的无菌水中，制成菌悬液，用梯