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标记免疫分析技术 （ Labeled Immunoassay Technique ） 上海同济大学生命科学与技术学院 何俊民 junmin-he@163.com 标记免疫分析技术 用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法 特点：敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果 三大标记免疫分析技术：放射免疫、荧光免疫、酶免疫 检测方法 检测范围 生化、常规免疫 mg~μg（10-3 ~10-6 g） 荧光免疫、酶免疫 μg~ng（10-6 ~10-9 g） 放射免疫、发光免疫 ng~pg（10-9 ~10-12 g） PCR pg~fg（10-12 ~10-15 g） 一、放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA） 女科学家 R.Yalow（美,1921~）1950’末 发明（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖 1. 基本原理 （1）竞争结合分析：Ag + Ab ? AgAb *Ag + Ab ? *AgAb （2）IRMA（免疫放射分析）： 2. 常用标记核素： （1）125I： γ 射线，半衰期 60 天 （2）3H： β 射线，半衰期 12.3 年 3. 测量仪器 （1）γ 计数仪 （2）β 液闪仪 4. 基本试剂 （1）标准品与质控品 a. 意义：放射免疫定量分析的尺度、质量控制的依据 b. 要求： 化学结构上——与待测物有相同的化学结构 化学纯度上——对竞争反应有干扰的杂质的含量低 含量准确 注意不变质与降解：在运输、保存时尤应注意；注意有效期 c. 种类：国际标准、国家标准、企业标准 （2）标记物 a. 对标记物的要求 比活度高：即单位物质的放射性强度高 生物活性及免疫活性与标记前改变小 放射化学纯度高：应 95% 稳定性好：标记的同位素不易脱落 b. 标记方法： 氯胺-T 法：最常用的 125I 标记法，I 与酪氨酸共价结合，方法简便，但易造成蛋白质的损伤 乳过氧化酶法： Iodogen（氯甘脲）法：固相法，标记率较高，损伤小，反应时间长 置换法： 3H 最常用 c. 标记产物的纯化：常用 Sephadex 层析，也可用硅胶 G 薄板层析或 HPLC 分离 d. 标记产物的鉴定：常用 RIA 法 最大结合百分率 标准曲线比较法 e. 半抗原的标记：必须先连接载体，常用牛血清白蛋白（BSA），再对载体作标记 （3）特异性结合抗体 a. 对特异性结合抗体的要求： 亲和力（affinity）高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结合的能力，用 K 值表示，反映灵敏度 特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的结合能力（交叉反应）低 滴度（效价）高：指结合 50% 标记抗原时抗体的稀释度高 稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳定 b. 抗体的制备 选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊 应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油 +卡介苗） 选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数 c. 抗体的纯化 去除杂抗体：用抗原吸附法 提取特异性 IgG：先用盐析法粗提，再用离子交换层析或亲和层析纯化 d. 抗体的鉴定 鉴定内容：效价、亲和力、特异性 鉴定方法：效价（琼脂单扩）、特异性（琼脂双扩）、RIA e. 单克隆抗体的使用： 用于 IRMA 或 RIA，特异性高 不一定优于传统的多克隆抗体 5. 竞争性放射免疫分析法的建立 （1）反应方式 a. 平衡法：标记抗原与待测抗原、特异性抗体同时加入温育 b. 顺序法：先加入待测抗原、特异性抗体温育一段时间后再加入标记抗原。可提高反应灵敏度 c. STAT 法：反应未达平衡时即测定，较难控制反应条件 （2）反应体系 a. 缓冲液：常用 0.05~0.1 mol/L pH 7.4~7.5 磷酸或 Tris-HCl 缓冲液。根据需要定 b. 反应体积：小体积可提高灵敏度，但增大了误差 c