常用方法学简介.ppt

3、酶 酶细胞化学反应的基本原理是利用酶对其相应底物的水解、氧化等作用，使底物的反应产物被某种捕获剂捕获并在原位沉淀，形成有色的终产物，借此测定该酶在细胞内的分布及活性强弱。 4、核酸 显示DNA的传统方法是Feulgen反应（Feulgen reaction），组织切片或细胞涂片先经稀盐酸处理，使DNA水解，醛基暴露，再用雪夫试剂处理，形成紫红色反应产物。 （四）免疫组织化学术（immunohistochemistry） 利用免疫学抗原和抗体特异性结合的原理，检测组织或细胞中的多肽和蛋白质等大分子物质的分布。为显示抗原抗体复合物的存在，需进行抗体标记；用荧光素如异硫氰酸荧光素标记，可以在荧光显微镜下观察，用胶体金标记，可以在电镜下观察，用辣根过氧化酶标记，则可在光镜下或在电镜下观察。常用的方法有直接法、间接法和亲和素-生物素复合物法（ABC法）等。 荧光的观察（按标本分类） 在荧光显微镜下观察的标本，当然必须发出荧光，可是大多数标本本身不能发出荧光，因而必须用荧光色素处理过才能发出荧光。 （A）自发荧光 （B）二次荧光 （C）抗体荧光技术 （A）自发荧光（不加染色） 有些物质不加染色，也能发出荧光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生物学（细胞学、生物组织、培养体等）领域中，只有很少物质具有自发荧光，常采用后两种方法。 测定物质的荧光光谱或者激发光谱，可以判定物质性质（荧光光度法）。 应用：生物学方面——判定维生素，研究生物学上的生物源的胺。 （B）二次荧光（用化学染色） 非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物等）用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二次荧光），以便进行观察，对特定物体选择合适的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别（分离）出来而可以观察到。 应用：吖啶橙+核酸 金胺+结核菌 介子奎二噁因+染色体 （C）抗体荧光技术（用免疫染色） 利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体和标本中的抗原进行抗原/抗体反应，这样两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。荧光显微镜最常用于抗体荥光技术进行观察，并成为医学、生物学很多领域中极为有用的工具。 Glial fibrillary acidic protein 荧光色素+物质 激发方法 吸收波长 辐射荧光 （自发荧光） 维生素A 紫外（UV） 325-345nm 470-490nm 维生素B6 紫外（UV） 356 432 儿茶酚胺 紫（V） 410（405-415） 480（475-485） 血清素（5-羟色胺） 紫（V） 390（385-400） 530（520-540） 叶绿素 兰（B） 520 650-660 荧光色素+物质 激发方法 吸收波长 辐射荧光 （二次荧光） 芥子奎二噁因 兰紫（BV） 450 500 四环素+骨，牙 紫（V）或兰（B） 390 560 吖啶橙+DNA 兰（B） 460 530 吖啶橙+RNA 兰（B） 460 650 金胺+结核菌 兰（G） 470 557 福尔根反应+DNA 绿（G） 550 650 溴化乙啶（EB）+DNA 绿（G） 545 605 Propidium Iodide（PI）+DNA 绿（G） 530 615 DAPI+A-T 紫外（U） 372 456 Mithramycin+G-C 兰紫（BV） 395 570 Olivomycin+G-C