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微丝的观察实验报告 　　实验二微丝的染色及形态观察　　【实验目的】　　1.掌握微丝的染色方法。　　2.了解光镜和电镜下的微丝基本形态和结构。　　3.了解细胞松弛素B对微丝的作用及原理。　　4.了解考马斯亮蓝染料在细胞生物技术中的应用。　　【实验原理】　　真核细胞胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架，在维持细胞形状和运动方面具有重要作用。根据组成成分和组装结构的不同，分为微管、微丝和中间纤维。微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。微丝由蛋白单体聚合形成，细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。细胞松弛素B对微丝的作用具有可逆性。　　考马斯亮蓝R250可以染各种蛋白,使蛋白呈蓝色。在该实验中微管等蛋白结构在光镜下无法分辨。我们看到的主要是微丝组成的应力纤维。　　体外培养的贴壁细胞应力纤维尤为发达，形态长而直，常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。　　【实验用品】　　1.器具：CO2恒温培养箱、倒置显微镜、超净工作台、低速离心机、普通光学显微镜、移液器、恒温箱、镊子、培养皿，载玻片、吸水纸。　　2.材料：盖片培养的成纤维细胞。　　3.试剂：PBS()、1％TritonX-100溶液、M-缓冲液、3％戊二醛固定液、％考马斯亮蓝染液、100μg/ml的细胞松弛素B、DMEM培养液。　　【实验步骤】　　1.从三张培养好的成纤维细胞贴壁生长的盖片平皿中，在超净工作台内将一张盖片移入另一平皿中继续培养，用作对照。　　2.在有两片盖片的平皿内，去除培养基，用PBS洗3次，再加100μg/ml的细胞松弛素B4滴于盖片上，继续培养半小时。　　3.将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理，另一张用培养液洗五次，继续培养、观察。两小时后细胞形状恢复，接近正常。　　4.对恢复的盖片与第一张没用药的盖片一同做染色处理。　　5.染色处理：　　(1)将需染色的盖片放入盛有PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片，换液3次，每次3分钟，洗去培养液。　　(2)将盖片移入1％TritonX-100液处理25～30min，室温或37℃均可。以提取骨架以外的蛋白质，使骨架图像清晰。　　(3)立刻将盖片移入M-缓冲液，换洗3次，每次3min。M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用。　　(5)将盖片移入3％戊二醛固定10min。　　(6)将盖片移入％考马斯亮蓝染液染液中，染色15min。然后小心地用自来水冲洗，空气干燥。　　【结果与观察】　　光镜观察，微丝聚集成的张力纤维束被染成蓝色，在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松弛素B处理的标本，由于微丝被破坏突起缩回。多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚合成微丝，细胞形状恢复正常。　　1.光镜下观察被染成蓝色的微丝聚集成的张力纤维束。　　2.注意观察正常对照片与用药处理后的标本成纤维细胞形状的区别。　　3.观察用药处理后又洗去药的标本中细胞形态是否恢复正常。　　【注意事项】　　1.洗片时要轻柔，以免把细胞从载片上洗去。　　2.恢复时间要足够，否则细胞不会恢复到未处理前的状态。　　3.操作中应注意区分细胞盖片的正反面。　　4.染色后应冲洗盖片背面，避免损伤细胞。　　5.1％TritonX-100抽提蛋白时，注意避免抽提时间过长破坏细胞结构。　　【思考题】　　1．绘出三种不同情况下细胞中微丝的分布。　　2．实验中设计对照组的作用及重要性？　　3．TritonX-100液、M-缓冲液、戊二醛及考马斯亮蓝在本实验中所起作用？　　实验一：细胞的形态观察及其大小测量　　一、实验目的：　　1、通过对原核和真核各种形态细胞的光学显微镜观察，了解细胞的形态及其显微结构；　　2、学习显微测量的方法，对细胞的大小有一直观认识。　　二、实验材料和仪器：　　小白鼠肝细胞切片；鸡血红细胞；蚕豆叶片横切片；　　普通光学显微镜；目镜测微尺；镜台测微尺；载玻片；盖玻片。　　三、实验步骤：　　(一)细胞形态观察　　l、动物细胞的观察　　人肝细胞切片：在显微镜下仔细观察肝细胞的形态构造。　　鸡血细胞涂片的观察：观察血细胞的组成；红细胞、白细胞、血小板的形态特点。　　2、植物细胞的观察　　取蚕豆叶片横切片的观察：注意表皮细胞和叶肉细胞的基本结构。　　细胞的大小和测量　　1、卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺刻度向下装在目镜的焦平面上，再旋上目镜的上透镜。　　2、将镜台测微尺刻度向上放在镜台上夹好，使测微尺分度位于视野中央。调焦至能看清镜台测微尺的分度。　　3、小心移动镜台测微尺和转动目镜测微尺(如目镜测微尺分度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦)，使两尺左