油气田土壤甲烷氧化菌实时荧光定量PCR检测技术的.pdf

微生物学通报 Jun. 20, 2014, 41(6): 1071−1081 Microbiology China © 2014 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.130448 研究报告 油气田土壤甲烷氧化菌实时荧光定量PCR 检测技术的 建立与应用 刘雅慈1,2,3 何泽2,3 张胜2,3 殷密英2,3 宁卓2,3 张翠云2,3* (1. 100037) (2. 050061) (3. 050061) 摘 要：【目的】建立快速检测甲烷氧化菌含量的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 技术，用 于油气微生物勘探。【方法】以含有甲烷氧化菌功能基因pmoA 片段的重组质粒为标准品，优 化实验条件，建立标准曲线，进行敏感性、重复性和特异性评价，并将该技术用于实际样品 的检测。【结果】该技术标准曲线的相关系数R2 为0.999 9 ，扩增效率为99.976% ，检测范围 1 9 为3.897×10 −3.897×10 copies/μL ，检出限约为40 copies/μL ，重复性实验中CT 值的变异系数 优于 3% ，对12 种非甲烷氧化菌均没有扩增，显示该技术具有很好的敏感性、重复性和特异 性。利用该技术对气田、油田和非油气田土样进行了检测，发现气田具有明显的异常高值。 【结论】为油气田的勘探建立了一种高效、特异、灵敏、准确的甲烷氧化菌荧光定量PCR 检 测技术，同时为其它指示菌检测技术的建立提供了参考。 关键词：甲烷氧化菌，实时荧光定量PCR ，pmoA 基因，油气田土壤 Development and application of a fluorescent quantitative real-time PCR technique for detection of methane-oxidizing bacteria in oil and gas field soil LIU Ya-Ci1,2,3 HE Ze2,3 ZHANG Sheng2,3 YIN Mi-Ying2,3 NING Zhuo2,3 ZHANG Cui-Yun2,3* (1. Graduate University of Chinese Academy of Geological Sciences, Beijing 100037, China) (2. The Institute of Hydrogeology and Environmental Geology, Chinese Academy of Geological Sciences, Shijiazhuang, Hebei 050061, China) (3. Hebei Key Laboratory of Groundwater Remediation, Shijiazhuang, Hebei 050061, China) Abstract: [Objective] We developed a rapid SYBR Green I fluorescent quantitative real-time PCR technique for detection of methane-oxidizing bacteria f