斜带石斑鱼肝细胞分离及原代培养方法的建立.pdfVIP

第 40 卷 第 4 期 水 产 学 报 Vol. 40, No. 4 2016 年 4 月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Apr., 2016 文章编号: 1000–0615(2016)04–0558–08 DOI: 10.11964/jfc.20150309796 斜带石斑鱼肝细胞分离及原代培养方法的建立 骆 源， 张春晓， 王 玲， 张冬玲， 霍振华， 宋 凯* (集美大学水产学院，厦门市饲料检测与安全评价重点实验室，福建 厦门 361021) 摘要：本研究以斜带石斑鱼肝细胞为实验对象，在不同培养条件下进行原代培养，旨在 探讨稳定可靠的斜带石斑鱼肝细胞分离及原代培养方法。采用组织块分离法和胰蛋白酶 (含EDTA) 消化法分离肝细胞，并通过密度梯度离心法分离纯化肝细胞，细胞悬液于 DMEM/F-12 、M199和L-15培养液中培养；细胞活力及数量采用血球计数板计数，并通过 MTT 法测定细胞增殖率；同时，测定不同时间培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、白 蛋白(ALB)和尿素氮(BUN) 的含量，以分析肝细胞生长状态。结果表明，组织块方法不 适于斜带石斑鱼肝细胞的培养，未见细胞从组织块中迁出，而胰蛋白酶消化法获得良好 8 稳定的培养效果，细胞产量达到1.6×10 个/g肝重，活细胞数达到95% ；L-15培养基细胞 生长明显优于DMEM/F-12和M199培养基；启动原代培养的48~72 h 阶段肝细胞生长代谢 旺盛，培养上清液中LDH 活性显著降低，ALB 和BUN 含量显著升高。结果显示， 0.25% 的胰蛋白酶常温消化法适合斜带石斑鱼肝细胞的分离，斜带石斑鱼肝细胞原代培 养的最适培养基为L-15培养基，肝细胞在启动原代培养的48~72 h 生长代谢旺盛。 关键词: 斜带石斑鱼；肝细胞；原代培养；细胞增殖率；肝细胞功能 + 中图分类号: Q 813.1 1；S 917.4 文献标志码: A 肝脏是机体新陈代谢的重要器官，在维持机 分解的研究。随鱼类肝细胞分离及培养方法的 [1] 体内环境稳态过程中发挥重要作用 ，肝脏为适 成熟，其已成为研究鱼类肝细胞功能的重要工具。 应环境变化不断调整肝细胞的结构和功能。研 目前，国内外主要用虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[8] 、 究表明，肝细胞能够表达绝大部分肝脏的功能 斑点鲖(Ameiurus nebulosus ) [ 9 ] 、鲤( Cyprinus [2] 。因此，国内外研究者多采用体外培养的肝细 carpio)[10]和草鱼(Ctenopharyngodon idella)[11]等肝细 胞代替活体动物来研究某些物质的毒理作用或 胞进行物质代谢等相关研究。斜带石斑鱼 代谢途径等。原代肝细胞较好地保留和维持活 (Epinephelus coioides)是一种高档海水养殖鱼类， 体肝细胞的完整形态及代谢活性，能够很好地