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细菌的简单染色实验报告 　　实验二细菌的简单染色、革兰氏染色　　虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。　　本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其他的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。　　一、目的要求　　1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。　　2．巩固显微镜的使用方法。　　二、基本原理　　1.简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。　　在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：　　带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫、碱性复红、番红等。　　细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。　　2.革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。　　G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。　　G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。　　革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染　　的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是复红。　　三、器材　　1、活材料：培养24小时的大肠杆菌和葡萄球菌。　　2、染色液和试剂：碱性美兰、结晶紫、碘液、95%酒精、石炭酸复红、蒸馏水、乙醚-乙醇混合液、香柏油。　　3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。　　四、操作步骤　　1、简单染色(转载于:写论文网:细菌的简单染色实验报告)：　　涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法取大肠杆菌涂片，调匀并涂成薄膜，注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀，做成浓菌液，注意取菌不要太多。　　晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。　　固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏　　染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min　　水洗：用水洗去涂片上的染色液，直至冲下之水无色时为止。　　干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。　　镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。　　2、革兰氏染色：　　涂片　　晾干　　固定，与简单染色法相同　　结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量的结晶紫染色液染色1分钟；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。　　媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。　　脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无