抗牛IFNγ单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立-预防兽医学专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 如需保密，解密时间 年 月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果．尽我所知，除了文中特另4加以标注和致谢的地3-外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材科，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意． 研究生签名：乏5训 时闻：W。锌‘月6日 学位论文使用授权书 煳 始加1摊名：懈明、， 签名日期：’寸o≤年‘月8日 签名日期： 沁。解6月g日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 华中农业大学2006年硕十学位论文摘 华中农业大学2006年硕十学位论文 摘 要 Y干扰素(IFN．g)主要由被抗原、有丝分裂素(ConA,PHA)等活化的Thl细胞、 CD8+细胞和NK细胞产生，除具有抗病毒、抗肿瘤活性外，还具有免疫调节作用， 如活化巨噬细胞、提高MHC I类和II类分子的表达、促进抗原提呈等，在机体免疫 控制和免疫病理中起着重要的作用。研究表明，外源性的IFN．Y既可以作为药剂用 于感染性疾病或肿瘤等的治疗，又可以作为免疫佐剂，增强疫苗的免疫效果；内源 性IFN—Y水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态，而抗原特异性的 IFN-Y反应则可以作为机体针对某种特定外来抗原的细胞免疫状态的指标。对应， 抗IFN．y的单克隆抗体(MeAb)作为研究、检测IFN．Y的手段，在免疫机制研究、免 疫功能检测等领域具有广泛的应用。IFN-Y的免疫学检测0FN-y试验)是在特异性抗 IFN-YMeAb的基础上建立的用于对样本中的IFN．Y进行定性定量分析的实验方 法，己被广泛地用于基础研究和临床免疫学、疫苗免疫效果评估，器官移植、过敏 反应以及胞内病原感染的诊断等。IFN．Y及其MeAb在畜牧兽医领域也有着广泛的 应用。国外已有学者将基因重组牛[FN-Y(rBovIFN．y)及其McAb用于牛病的研究， 抗原特异性的牛IFN．Y试验已在很多发达国家被用于多种牛疫病的检测，尤以在牛 结核病诊断中的应用最为广泛，相关的研究也最为深入，国内这方面研究的报道比 较少。最近几年来，随着基因克隆、重组、表达及单克隆技术的不断发展、成熟， 通过基因工程手段制备rBovIFN．Y并在此基础上制备其MeAb成为可能。本实验克 隆并表达BovIFN．Y，制备抗牛IFN．Y单克隆及多克隆抗体，建立可检测牛IFN-y 的双抗体夹心间接ELISA方法。 1．BovlFN．Y在大肠杆菌中的表达及其产物的鉴定 通过PHA刺激，从全血培养上清提取BovIFN．v mRN根据BovIFN．Y基因 的已知序列设计引物，经过RT-PCR扩增出BovIFN．yeDNA，定向插入原核表达质 粒pET-28a(+)，构建原核表达重组质粒，经测序确认，转化大肠杆菌BL21，经IPTG 诱导，表达出大小在22kDa左右的蛋白；并对表达条件进行了优化． 2．rBovlFN-Y MeAb的制备与鉴定 本研究以纯化的原核表达融合蛋白BovlFN．Y为免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤 技术，研制出4株稳定分泌抗BovIFN-Y单克隆抗体的细胞株，分别命名为A7、A10， G6、G10，免疫球蛋白亚类鉴定都为igoI，腹水效价为l：29X 100、l：2toX 100、l： 29X 100、l：29X 100，Western-blot分析显示，4株单抗均能特异性结合22kDa的 BovIFN-g，ELISA试验表明，4株单抗只与融合蛋白BovIFN．y反应，而不与A985B、 ESAT-6-CFP-10、GMCsF反应，表明4株单抗均为针对BovIFN．Y的特异性单抗。 4 抗牛y．干扰素单克隆抗体制各及ELISA方法检测方法的建证3．双抗体夹心间接ELISA方法建立 抗牛y．干扰素单克隆抗体制各及ELISA方法检测方法的建证 3．双抗体夹心间接ELISA方法建立 选取单抗A10、纯化的多克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔酶 标二抗，建立双抗夹心间接ELISA方法。检测BovlFN-Y。实验结果表明，此ELISA 敏感性达到75ng／ml，特异良好，不与其它检测抗原不反应。此ELISA方法为建立牛 IFN．Y实验检测方法奠定了基础。 关键词：奶牛结核病；单克隆抗体；ELISA；BovlFN．Y 竺±奎些盔兰!堂笙堡!兰竺堡苎ABSTRCT 竺±奎些盔兰!堂笙堡!兰竺堡苎 ABSTRCT IFN-Y was produced mainly by activated