07微生物监测技术的新发展.pptx

1;目前研究较多的是应用核酸探针、PCR技术等生物高技术进行环境检测。 一、核酸杂交技术 探针是能与特定核苷酸序列互补、已经标记的DNA（或RNA）片段，可以检测样品中是否存在待测的特异核酸序列(往往是某种微生物的保守性片段）。 杂交是样品中提取的核酸分子与探针互补序列间的配对过程，杂交结果可以通过探针的放射性或非放射性标记被灵敏地检测。;可以获得众多传统技术难以培养或鉴定的自然种群的DNA信息。 跟踪环境中特定的基因及其宿主微生物； 可以在同一时间研究多种的微生物； 研究基因组的组织上的变化以及自然界中基因表达的调控等； 利用DNA和RNA探针检测、跟踪环境中特定的基因或DNA序列及其宿主微生物。 当前的热点是利用高度特异的寡聚核苷酸探针直接与细胞内的、或从细胞中提取出来的rRNA以及从rRNA经反转录而来的rDNA杂交，从而检测到混合样品中特定微生物的存在。 ;不同的微生物其ｒRNA基因序列在某些位点会以不同的几率发生突变，但是它们本身又具有高度的保守性，形象地说，它们可以作为生物进化史的计时器，其序列的相似程度可以反映出它们在系统发育上的关系。 早在十多年前 ,最小的rRNA分子—5S rRNA就已被用于分析一些简单的微生物群落的组成。不同微生物类群的5S rRNA分子被直接从混合样品中提取出来 ,再通过电泳分离 ,最后经过测序及序列的比较分析就可以知道有关的微生物在系统发育上的相对位置。然而 ,大小仅 120个左右核苷酸的 5S rRNA分子携有的信息量十分有限 ,而且电泳分离的步骤限制了它在复杂的微生物生态系统中的应用。随后 ,有关的研究重点被集中于发展分子量更大、携带信息量更多的ｒRNA分子—其中主要是小核糖体亚单位rRNA分子 (原核生物的 16S rRNA和真核生物的 18S rRNA)—的分析方法上。;16S rRNA分子约有 1500个核苷酸，当其全序列或大部分序列 (至少1000个核苷酸以上 )被分析时，就可得到有关微生物在系统发育方面的足够信息并因此知道它们在系统发育上的位置，从而鉴定各种微生物。 而利用基于这些信息而设计的寡核苷酸探针既可以直接在环境样品上进行原位杂交，或与浓缩富集的样品进行全细胞杂交，也可以与从环境样品中提取出的DNA或ｒRNA进行定量点渍杂交，或与rDNA的扩增产物杂交，从而可以得到特定微生物在环境中的存在、分布和丰度以及整个微生物群落的组成、结构及其多样性等全面的信息。到目前为止，利用此项技术已对众多的生态样品进行了分析，并且发现了许多新的微生物种。 ;利用核酸杂交技术研究环境样品中的微生物有以下优点 : ①核酸可以直接从样品中提取而不必通过微生物培养的步骤得到 ； ②不管基因表达与否 ,都可以检测到特定的基因或核酸序列 ,从而能准确地跟踪、监测特定的微生物种群； ③同一样品可以同时检测到众多不同的微生物类群。;核酸杂交技术在环境上的应用的一个重要局限是它要比传统的方法复杂得多。 ①从各种环境样品中提取核酸本身就包含众多繁冗的抽提和纯化操作 ,因而也是其中最复杂的步骤之一。 ②对任何一个自然微生物群落的研究常常需要对其多个平行样品进行分析和统计 ,而目前而言要用核酸杂交技术分析如此众多的样品实际上相当困难。 ③核酸杂交技术的灵敏度尚需大幅度提高。而要将特定的微生物或核酸序列从富含与它亲缘关系较近的其它微生物的背景中检测出来 ,也要求一些特殊的方法。; 二、DNA扩增技术;（二）PCR技术的基本原理 利用细菌遗传物质中各种属菌种高度保守的核酸序列，设计出相应引物，对提取到的细菌核酸片段进行扩增，然后用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果。它是一种具有选择性的体外扩增DNA或RNA片段的方法。其特异性由两个人工合成的引物DNA序列决定。 所谓引物是指与待扩增核酸片段两端互补的寡核苷酸，其本质是ssDNA(单链DNA)片段。15-30bp，另外，引物之间不能有两个以上碱基互补，特别在3‘端。;PCR过程包括：1.双链DNA（模板）加热变性为单链；2.引物与模板DNA单链结合；3.引物延伸（扩增）。 热变性—复性—延伸的一个周期过程称为一个PCR循环(如图)。PCR全过程就是在适当条件下的这种循环的多次重复。首次PCR中延伸的产物在进入第二次循环变性后，再与引物互补，充当引导DNA合成的新模板。因此，第二轮循环后．模板由首轮循环后得到的4条增为8条(包括原始模板在内)，依次类推，以后每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。从理论上讲，扩增DNA产量可呈指数上升，即n个循环后，产量为2n拷贝。 ;;（三）PCR技术检测环境微生物的步骤 应用PCR技术检测环境样品中特定的微生物类群，其基本步骤主要包括： 1.从环境样品中提取微生物遗传物质DNA或RNA，这