革兰染色实验报告.docx

革兰染色实验报告 　　实验原理：　　1）G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫—碘复合物从胞内渗出。G-菌的细胞壁结构疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖又均含大量脂质，易被乙醇溶解，导致细胞壁通透性增加，胞内结晶紫-碘复合物被乙醇溶解析出而脱色。　　2）G+菌等电点比G-菌低，在相同PH条件下，G+菌所带负电荷比G-菌多，故与带电的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。　　实验步骤：　　一、标本的制备：　　1、涂片：　　取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握菌种管，有搜持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌，待冷却后，取斜面培养的葡萄球菌或大肠杆菌少许与盐水混匀，直接取1~2环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。　　2、干燥：　　目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰，以致标本烤枯，不堪检视。　　3、固定：　　手执玻片一端，标本面向上，在火焰外层快速地来回通过三次，共2-3秒，以玻片反面触及皮肤不觉过烫为度。冷却后，染色。目的是杀死细菌，是菌体与玻片粘附较牢以及改变对染料的通透性，因活的细菌一般不能使许多染料进入细胞。　　二、染色　　1、初染：　　将涂片标本夹持于左手，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色1~3分钟，用流水缓缓冲洗直至无颜色流下为止。　　2、媒染：　　加卢戈氏染液4~5滴作用30秒到一分钟，再按上法冲洗，并将片上积水轻轻洒净。　　3、脱色：　　在95%酒精缸中脱色约3~5秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反复2~3次，直至流下酒精略呈淡紫色为止，现按上法以流水冲洗，并将玻片轻轻洒净。　　4、复染：　　用稀释石炭酸-复红复染半分钟后按上法冲洗。　　5、镜检。　　实验结果：G+葡萄球菌被染成紫色；G-大肠杆菌被染成红色。实验分析：实验中有些组的大肠杆菌被染成了紫色，而实际却应该为红色，这有可能与脱色的时间过少有关，因而将其染成紫色，　　成为假阳性。　　还有一些组将葡萄球菌染成红色，这又可能是由于脱色时间过长，冲洗的时间过短所导致的。　　G+葡萄球菌　　G+链球菌G—大肠杆菌　　G霍乱球菌的使用和保养。　　2.学习细菌革兰氏染色实验。　　3.用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片并判断其结果。　　二、实验原理　　革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。染色前必须先固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。　　三、实验材料和用具　　菌种：培养12-16h的苏云金杆菌或者枯草杆菌，培养24小时的青枯假单胞杆菌。　　染色液和试剂：吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液、结晶紫、鲁哥尔碘液、95%酒精、复染剂、二甲苯、香柏油。　　器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、打火机、记号笔、擦镜纸、显微镜。　　四、实验步骤：　　①涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，做成菌液。干燥制成薄的涂面，注意取菌不要太多，过火速度要快。　　②初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至无色。③媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1min，后水洗。　　④脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20sec，后立即用流水冲洗。⑤复染：滴加复染剂——番红染色液，染3－5min，水洗后用吸水纸吸干。　　⑥镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察染色结果并绘图。　　五、实验小结　　简述革兰氏染色实验的一般步骤。　　哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？　　革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？　　将实验结果填入下表并绘所观察到的细菌简图　　实验结果：　　★注意事项1、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定，需要多加练习；　　2、选