南华大学药学与生物科学学院药物分析课件 第十三章.ppt

第十三章 生化药物和基因工程药物分析概论 第一节 概 述 一、药物分类 1．生化药物： 例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。 三、特点 1. 生物体的基本生化成分  2. 分子量大: 分子量测定  3. 结构难确证  4. 全过程的质量控制：原料、生产过程、 最终产品 5. 生物活性检查 一、鉴别 理化鉴别法：化学鉴别法 紫外分光光度法 HPLC法生化鉴别法：酶法 电泳法 等电聚焦法生物鉴别法：家兔惊厥试验 2.紫外分光光度法 溶剂：0.01mol/L盐酸 例：三磷酸腺苷二钠 浓度：20μg/ml 判断： λmax：257±1nm A250/A260：0.17～0.27。 3. HPLC法： 利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留 时间和肽图谱的一致性进行鉴别。 4.酶法： 例：尿激酶的鉴别---气泡上升法 原理： 方法： 取小试管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤维蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即置37℃±0.5℃恒温水浴保温，记时。反应系统在30～40秒内凝结，凝结块内有气泡生成，15分钟内凝结块溶解，当凝结块溶解时，气泡逐渐上升。以0.9%氯化钠作空白，同法 操作，凝结块在2小时内不溶。 6. 生物法： 利用生物体进行试验来鉴别药物。 例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。 利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%GS，惊厥停止。 （三）安全性试验 热源试验  异常毒性试验 :急性毒性物质  过敏试验：异性蛋白 降压物质试验：导致血压降低的杂质、组 胺、类组胺 （四）含量测定生化药物和基因药物的含量表示方法：百分含量：适用于结构明确的小分子药 物或经水解后变成小分子的 药物。生物效价或酶活力单位：适用于酶类、 蛋白质类药物。  测定： 样品---肽  样品水解：5.7mol/L盐酸，0.1%苯酚、通N2， 110℃，20h ～24h。  样品干燥：真空  样品的衍生化：丹酰氯  水解剩余的衍生化试剂：0.4mol/L NaOH 进样测定 3）HPGFC 应用：蛋白质、多肽的分离及分子量测定。 示例：重组人肿瘤坏死因子衍生物的分子量 的测定 柱：Beckman Ultraspherogel SEC 3000 流动相：0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4 （1:1）0.05%叠氮化钠 连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续检测。 检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。 每30s A的改变：0.015～0.018，呈线性关系的时间不得少于3min。 相当于的单位数为 每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为 重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽图分析 肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。 1。酶切条件 取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%ＮＨ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至微量进样瓶,加0 3ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切,每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析,直至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳酶切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切,酶切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致,