间接免疫荧光法实验操作常见问题(20110524).pptVIP

间接免疫荧光法所遇问题的解决方法 实验操作 避免错误 识别错误的来源 间接免疫荧光法操作流程（2） 间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (1) 清洁工作台 用通常的家用洗涤剂和蒸馏水清洗加样板的反应区，用纸巾吸干。 在作某些特殊检测时需要使用消毒液清洗加样板。 只有当生物薄片载片平衡到室温后方可打开包装。 可用防水的黑色标记笔在生物薄片载片的正面作标记。 只能在手可触摸的区域作标记。 不要触摸生物薄片。 间接免疫荧光法工作台的布置 间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (2) 间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (3) 间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (4) 确保液滴与生物薄片接触良好。 避免样本之间相互接触。 避免快速移动加样板。 确保生物薄片与加样板的反应区吻合良好。 避免缩短或延长温育时间。 间接免疫荧光法问题的解决方法(5) 用PBS-吐温缓冲液流水迅速冲洗载片 (用大口杯，不要用细颈瓶)。 流水冲洗载片后立即放进盛有PBS-吐温缓冲液的小杯中浸洗。 间接免疫荧光法问题的解决方法(6) 间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (7) 从小杯中垂直取出载片。 用事先叠好的纸巾从背面擦拭载片。 不要擦拭反应区之间的间隙。 5秒钟内进行第二次温育。 从现在开始，避免阳光直射载片，直至实验结束。 间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (8) 可用聚苯乙烯封片板。 盖玻片上每反应区滴加PBS-甘油8ul，不要超过10ul。 用纸巾擦拭载片的背面和四周，不要擦拭反应区间隙。 将载片有生物薄片的一面朝下，盖在已准备好的盖玻片上，将盖玻片粘起来。 立即检查盖玻片与载片是否吻合良好 ，必要时可调整盖玻片的位置。 封片 间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免(9) 间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的来源(1) 当出现问题时，我们应该检查： 组织切片完整与否。 基质是否有缺损。 组织形态是否完整。 .... 间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的来源(2) 间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的来源(1) 当出现问题时，我们应该检查是否有： 图像不清 气泡 荧光强度减弱 组织有非特异反应 组织根本不反应 对照 参照 参照 参照 使用自来水配置PBS-吐温缓冲液 使用蒸馏水清洗浸泡载片 PBS-吐温缓冲液常温（25℃）放置1周 缓冲液配置只使用PBS 清洗时只冲洗不浸泡 酶结合物1：10稀释 二抗加样量过多 二抗加样量少 37℃温育 由于掀盖玻片所引起的基质损坏 EUROIMMUN 灰尘颗粒 EUROIMMUN 组织折叠 EUROIMMUN EUROIMMUN 没有进行血清温育 EUROIMMUN 没有进行二抗温育 载片过度干燥(1) (血清温育后5分钟Hep-2细胞) 过度干燥 EUROIMMUN 过度干燥 载片过度干燥(2) (血清温育后5分钟猴肝) EUROIMMUN Trocknung nach Konjugatschritt BIOCHIP Mitte (20er) 载片过度干燥(3) (酶结合物温育后5分钟) 过度干燥 EUROIMMUN 载片保存不当 (温度或湿度过高) 温度或湿度过高 EUROIMMUN 正常操作 使用自来水配置 PBS-吐温缓冲液： 细胞不清晰，背景不干净 正常操作 使用蒸馏水清洗浸泡载片： 细胞肿胀变形，滴度下降 正常操作 PBS吐温缓冲液 常温放置1周： 背景不干净 正常操作 缓冲液配置只使用PBS： 背景不干净，1：100滴度结果变阴性 正常操作 清洗时只冲洗不浸泡： 结果转阴，可能出现 Hep-2阴性，肝片阳性 结果 正常操作 酶结合物1：10稀释： 中滴度结果转阴 正常操作 二抗加样30ul： 荧光有增强 正常操作 二抗加样量为15ul： 荧光减弱 * 间接免疫荧光法实验操作常见问题 及解决方法 EUROIMMUN EUROIMMUN 准备 稀释 加样 血清温育 清洗 间接