免疫标记技及分析应用.ppt

第七章 免疫标记技术及分析应用 第一节 免疫标记技术 第二节 免疫荧光技术 第三节 免疫酶技术 第四节 放射免疫技术 第五节 免疫胶体金标记技术 荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶 常用的荧光素 荧光检测仪 （1）荧光显微镜 （2）荧光分光光度计 （3）流式细胞仪 （4）荧光偏振光分析仪 荧光显微镜的构造 （1）直接荧光染色法 将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测抗原。 优点：简单、快速、特异性高。 缺点：敏感性差。 （2）间接荧光染色法 将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特异性抗体。 （3）补体荧光染色法 将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。 优点：可检测所有的抗原抗体系统，具通用性；敏感性高。 缺点：操作流程长、干扰因素多、非特异性荧光多，补体易失活、需新鲜制备不方便。 Enzyme Immunoassay（EIA） 就是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 抗原抗体反应＋酶催化反应 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计 特异、敏感 可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在μg、甚至ng水平上对其进行定量。 将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。 滴加底物溶液后，底物可在酶作用下催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。 优点： ①灵敏度高，特异性强； ②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于普查； ③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素污染； ④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； ⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； ⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。 缺点： 标记反应较难掌握，在操作过程中容易引起酶、抗原或抗体的失活。 一、常用的酶及其底物 酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）；无害；稳定，价廉、易得。 二、 标记方法 酶结合物 技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原的聚合物。 戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶 改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2-NH-IgG 三、酶标记物的纯化及鉴定 1、纯化 游离酶：增加非特异染色 游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色 葡聚糖凝胶层析法 50%饱和硫酸铵沉淀提纯法 2、鉴定 免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA 酶标记率测定：分光光度法 四、酶标仪（酶联免疫检测仪） 比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量的软件，自动洗板、温育、加样 450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm ELISA种类 1. 直接法 2. 间接法 3. 夹心法 4. 竞争法 5. 捕获法 direct ELISA—for Ag direct ELISA—for Ab 2. 间接法 3. 夹心法： 双夹心法 （1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。 （2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 （3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 利用放射性同位素标记技术检测抗原的技术 灵敏度高，用于检测激素等血清中微量物质 Rosalyn Yalow （美国） 与此同时，Ekins利用竞争性蛋白结合分析技术测定甲状腺素获得成功 开创了生物活性物质微量测定技术的新时代，是微量分析方法学上的一个突破。 放射免疫技术 优点： ① 特异性强，即抗原抗体的特异性反应； ② 灵敏度高，结果精确，检测范围10-9?10-12g； ③ 操作流程简单易行，加样程序简单，测量和 数据处理自动化； ④ 样品用量少、一般无需复杂的提纯步骤； ⑤ 应用范围广泛，尤其是测量小分子半抗原。 缺点： 需要昂贵的检测仪器；同位素污染。