亲和层析原理和步骤.pptVIP

实验 亲和层析法分离豌豆凝集素 * 首先寻找能被该分子识别和可逆结合的生物专一性物质，称为配基。 其次把配基共价结合到层析介质（或称载体），使配基固定化。 最后把固定化配基填充在层析柱内，制成亲和层析柱。 * 配基可以是小分子物质：一些辅酶、辅基 大分子物质：酶、抗体 * （1）? 纤维素 优点：来源丰富，可供偶联基团较多，偶联后基团又能突出在载体外 缺点：结构不均匀，使偶联上配基浓度不一 非专一吸附强 易受氧化生成醛基 （2）? 葡聚糖凝胶：经环氧氯丙烷交联，立体网格多糖类，物化性质稳定，可用强碱除去非特异吸附杂质。 琼脂糖凝胶：D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相间结合的链状多糖，用于亲和层析为交联珠状凝胶。 PAG具较多酰胺基，可制得配基含量较高。适用于配体和亲和物之间亲和力较弱的系统。 避免在PH2-11以外的溶液中长期使用，防止胺基水解。 * 1、??? 配基的选择 需仔细研究大分子同配基之间作用的性质 1、??? 亲和势 是配基对互补分子亲和力大小的量值，也是制备高效亲和柱的重要参数，一般在10－4－10－8M之间。解离常数高则不易连接，但解离常数太低，又会洗脱困难，如生物素－抗生物素蛋白解离常数为1×10－15M，要用pH1.5的6M胍-HCl才能洗脱。 1、??? 配基浓度 对亲和势较低系统（KL≥10－4M），增加配基浓度有利于吸附。但配基浓度太高易使配基活性中心互相遮盖，吸附力下降。同时非特异吸附增加。当增加配基浓度有困难，而亲和势又较低时，可用增加亲和柱的长度来提高吸附效率。 配基浓度太高又可使洗脱困难。 推荐配基浓度为1－10微克分子配基/毫升凝胶，约2μmol/ml为最好。 配制加入量比要求偶联量大几十倍。蛋白类配基含量5－10mg/ml。 2、??? 配基偶联的位置 需选用合适的，不影响与大分子连接的部位。 3、??? 配基大小的选择 亲和柱制备首选大分子配基。 * KL越小，配体对大分子的亲和力越高，在亲和层析中就越有价值。 * 1、??? 载体的排斥效应 小孔经凝胶会明显阻止大分子物与配基结合 2、??? 载体的空间障碍 载体影响了配基的空间，特别是小分子配基。需加碳氢链“手臂”，长度需适中。 * 影响吸附的因素 缓冲液离子成份强度、pH、温度等都有影响。 流速尽可能慢，10ml/cm2.小时 上柱样品用平衡层析柱缓冲液溶解，浓度约20mg蛋白/ml. 上样体积取决于亲和势，低则上样量减少，一般柱床体积的5％。 * ?非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度、介电常数?物质构象改变?浓缩?洗脱?立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复到天然结构 离子洗脱能力强弱：CL-I-ClO4CF3COO-SCN≤CCl3COO- 蛋白质变性剂，脲或盐酸胍，洗脱后立即稀释或透析。 如吸附通过疏水作用，可用降低极性的缓冲液洗脱（乙二醇）。 ②? 特殊洗脱法 当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。 断键方法： 硫酯键： 用pH11.5（或1N）羟胺处理半小时 偶氮键： 0.1M连二亚硫酸钠的0.2M硼酸缓冲液（pH9） 二硫键：用巯基乙醇，半胱氨酸，二硫苏糖醇处理 ③? 专一洗脱方法 以酶为例： 竞争性效应――ESI不如EI稳定，可用游离配基或抑制物（I）洗下，正洗脱。 非竞争性效应――ESI与EI同样稳定，I不能用作洗脱剂。 反竞争性效应――ESI比EI稳定，可去除杂蛋白，然后减少I浓度洗脱。 双底物酶――吸附时存在另一底物，从洗脱液去除时就可洗脱，负洗脱。 亲 和 层 析Affinity Chromatography? 一、原理 亲和层析是利用生物大分子所具有的专一亲和力而设计的纯化技术 寻找配基 配基固定化 制成亲和层析柱 基本过程 + 固相化 + + 洗脱 吸附 解吸 + 载体 样品 固相化 再生 酶： 基质类似物，抑制剂，辅酶 抗体： 抗原，病毒，细胞 细胞： 细胞表面特异蛋白，外源凝集素 核酸： 互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶 激素或药物： 受体，载体蛋白 外源凝集素： 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞 常见具有专一性亲和力的生物分子对： （一） 载体的选择 1、载体要求： （1）不溶性 （2）渗透性：疏松网状结构，有良好的液 体流动性 （3）化学和机械性能稳定 （4）具备大量能被活化的基因 （5）抗微生物和酶的侵蚀 2、常用载体 （1）纤维素 特点：价廉、来源充足