第七章章节 常用分子生物学技术资料.pptVIP

第 一 节 基因工程 Genetic engineering 二、工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 多核甘酸激酶等 三、重组DNA技术的基本原理 第二节 PCR概述 PCR技术的创建 很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一 Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…... Mullis的第一个PCR实验 1983年9月中旬 Mullis在反应体系中加 入DNA聚合酶后在37 ℃一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。 PCR的发展史 1983年春，Mullis发展出PCR的概念； 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环； 1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的； 1988年，第一台PCR仪问世； 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。 PCR不只是一个方法改进 Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”； 到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红； Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。 一、PCR的定义 在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。 PCR循环--变性 PCR循环--变性 PCR循环--变性 PCR循环—退火 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 PCR整个过程 PCR product 经典循环参数（500bp以内） 7）重组PCR 将两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。 即先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物进行PCR扩增。所得到的产物是一个重组的DNA. 五 PCR反应特点 （一）特异性强 靶序列的特异性决定扩增产物的特异性。 在较高的温度下进行，引物结合的特异性大大增加。 （二）灵敏度高 PCR 产物的生成量是以指数方式增加 从 100 万个细胞中检出一个靶细胞 在细菌学中最小检出率为3个细菌 （三）简便、快速 在DNA扩增仪中进行变性-退火-延伸反应，一般1～3 小时完成。 （四）对模板的纯度要求低 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA或RNA扩增检测。 I am really happy to be your teacher of this course,thank you for your coorperation in my class. Wish you be successful in the future! Happy New Year! 三、PCR的反应体系和方法 PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温