课件：八克隆基因的表达.ppt

第八章 克隆基因的表达 一、基因表达： 二、克隆基因的表达： 第一节 外源基因在原核细胞中的表达 一、原核生物基因表达的特点 3. 转录和翻译偶联、连续进行。 Shine-Dalgarno（S-D）sequence: 二、原核表达系统的注意事项 三、原核生物基因表达的调控 consensus sequences ① -35box 原核启动子共有序列的功能 （2）翻译的起始位点 ii）起始密码： 2. RNA多聚酶 3. 转录终止子 原因： 4. 翻译终止密码 （2） 乳糖启动子lac 阻遏物与DNA的结合 ①乳糖操纵子控制区的结构 （3）色氨酸启动子trp 色氨酸操纵子 （4）PL和PR启动子 cI857: 四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 2. 周质中表达 （3）常用的原核信号肽 （2）真核信号肽 3. 胞外表达 五、几种类型的原核表达载体 （1）pKK223-3 载体 2. 分泌型表达载体 pIN III-comA1 3. 融合蛋白表达载体系统----pGEX系列 （3）产物提纯 （4）产物分离 pGEX （5）其他融合蛋白系统 人胰岛素在大肠杆菌中的表达 六、影响外源基因表达效率的因素 （2）-35区与-10区之间的距离 2. 转译起始序列对表达效率的影响 （2）起始密码AUG （3） 其它 4. 转录终止区对表达效率的影响 七、提高表达水平常用的方法 ?PL启动子是温度诱导型 tac启动子是药物诱导型 （2）表达载体诱导复制 （1）设计成融合蛋白 ??Z系列载体： （2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 （3）表达分泌蛋白 细菌蛋白分泌的条件： 八、细菌表达载体举例 pTYB1, pTYB2的 MCS 2. pTYB11，pTYB12: intein在N端 pTYB11, pTYB12的 MCS 利用Intein 分离纯化外源蛋白 3. pTYB系列的特点 九、外源蛋白质表达后的正确修饰 人胰岛素分子 2. 前体切割 3. 蛋白质糖基化 4. 氨基酸残基的修饰 十、原核细胞表达的缺陷 第二节 外源基因在真核细胞中的表达 一、在酵母中表达 （1）整合型载体(YIp) 特点： （2）复制型载体(YRp) ARS 特点： （3）着丝粒质粒(YCp) （4）附加体型载体(YEp) 2?m质粒： 特点： 2. 酵母转化和表达的一般过程 3. 酵母表达系统的特点 （2）缺点 4. 在啤酒酵母中表达的重组蛋白 5. 在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式 （2）表达分泌型蛋白 信号肽的切割： 6.其它酵母表达系统 ②表达载体构建（整合型）： 整合到染色体中 （2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表达 二、昆虫培养细胞表达系统 ②多面体形式 （2）杆状病毒的表达特点 3. 转化子筛选 4. 杆状病毒转化载体 转移载体 （2）杆状病毒载体转化过程 4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白 5. 杆状病毒大规模表达存在的问题 6. 构建可持续表达的载体 三、外源基因在植物中表达 Ti plasmid （1）Ti质粒的结构 ①T-DNA（transfer-DNA） 细胞分裂素基因 冠瘿碱（opine）的类型和化学结构 冠瘿碱（opine）的作用 ②毒性基因（vir） ③冠瘿碱代谢基因 2. 农杆菌的感染和生存 3. Ti质粒的种类 （2）胭脂碱（nopaline）型质粒 4. Ti质粒转化的对象 6. 天然Ti质粒作载体的缺点 7. Ti质粒的改造 8. Ti载体的类型 卸甲载体：是解除武装的Ti质粒，删除了T-DNA上的onc基因和冠瘿碱合成酶基因等，其功能作为构建转化载体的受体质粒。 中间表达载体：是含有植物特异启动子的中 间载体，其功能是作为构建转化载体的供体质粒。克隆在大肠杆菌中。 转化时，外源基因先克隆在中间表达载体上，再通过卸甲载体和中间表达载体的同源重组形成质粒的共合体。 ②外源基因插入pGV3850的过程 ③选择标记 三亲融合（三亲交配）法 （2）双元载体（binary vectors） ②双元载体的转化 四、在哺乳动物细胞中表达 SV40 Virus （2）SV40感染和生存方式 (3) SV40DNA的复制 ②SV40 复制起始位点 (4) SV40病毒的转录和翻译 (5) SV40病毒的整合 (6) SV40病毒的包装 (8) SV40混合传染过程 (9) COS细胞 （4）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。 （5）加入大肠杆菌的复制起始位点和选择标记。 （6）加上真核生物的转录信号和结束信号以及添 加polyA的信号序列。 （1）保留T-DNA的转移功能部分（边界）。 （2）减少限制性酶切位点，引入单