苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究.docxVIP

苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究 【摘要】 目的 探讨苏云金芽孢杆菌的亲缘关系,为Bt鉴定、安全性评价及降低其致病风险等提供 科学 依据。 方法 采用肠杆菌基因间重复一致序列-PCR技术，对6株苏云金芽孢杆菌和3株蜡状芽孢杆菌及对照菌株的基因组DNA进行扩增，对其指纹图谱进行 分析 ；回收并克隆重复性好的苏云金芽孢杆菌基因组DNA扩增片段，以其为探针，分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。结果 与蜡状芽孢杆菌相比，苏云金芽孢杆菌菌株间基因组DNA指纹图谱较一致；所有供试苏云金芽孢杆菌菌株均扩增产生一条250bp左右的片段；苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌均可扩增产生600bp左右的共有DNA片段。此外，以苏云金芽孢杆菌500bp片段为探针与苏云金芽孢杆菌基因组DNA杂交有很好的特异性。结论 肠杆菌基因间重复一致序列-PCR指纹图谱可以正确反映苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系；500bp片段可以作为苏云金芽孢杆菌鉴定探针。  【关键词】 苏云金芽孢杆菌  苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis,Bt)与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus,Bc)同属于蜡状芽孢杆菌菌群，为 自然 界中广泛分布的革兰阳性菌〔1〕。其中Bt在其休眠期可形成对昆虫有毒性的伴胞晶体。因此，被作为生物杀虫剂广泛 应用 于农业及卫生害虫的生物防治；Bc则是人畜条件致病菌，可导致人食物中毒和感染，引起呕吐和腹泻〔2〕。 研究 表明，在自然环境中，两者染色体体外遗传物质可以出现高度重组〔3〕，在DNA水平也具有较高的同源性，只有个别碱基有差异〔4〕。由于Bt与Bc的相似性，许多细菌分类学家认为Bt与Bc应为同一个种〔5〕。Bt和Bc间的同源性关系，使Bt安全性 问题 越来越受到人们重视。因此，为研究两者的亲缘关系，对Bt的鉴定、Bt应用的安全性评价，以及进一步提高Bt杀虫效力、降低其致病风险，本文利用肠杆菌基因间重复一致序列－PCR技术〔6〕对Bt和Bc全基因组DNA进行扩增，对获得的Bt和Bc基因组DNA指纹图谱进行分析，探讨Bt和Bc起源进化关系，同时筛选并克隆了Bt基因组DNA扩增片段，对应用ERIC-PCR技术鉴别、鉴定Bt和Bc进行可行性探讨。结果报告如下。  1 材料与方法  11 材料  111 菌株 Bt株，Bc标准株1株，大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等对照菌株各1株〔购于 中国 普通微生物菌种保藏中心试剂：Ex-Taq酶、IPTG、X-gal；pGEM－T vector连接转化试剂盒及JM109高效率感受态细胞；放射性同位素〔α-32P〕-dCTP和随机引物DNA标记试剂盒；尼龙膜及3MM滤纸；其他试剂为本实验室自配，均为分析纯。  12 方法  121 菌株培养及其基因组DNA的提取 斜面活化的菌株在LB 培养基中30℃摇床培养过液(200r/min) ,离心收集2ml 培养的菌体(4000r/min ,10min ,20℃) ,采用实验室常规酚/氯仿法提取各菌株基因组DNA。所提取DNA经Beckman DU～640检测，吸光度A260/A280值在18～19之间，纯度符合PCR扩增条件。 　　　　122 ERIC-PCR反应条件及结果鉴定 (1)反应体系组成和反应条件:依据 文献 方法〔7〕。PCR产物进行15％琼脂糖凝胶电泳。DNA标准分子量为DLXX，PCR产物经溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像系统上照相。 123 PCR产物回收与克隆 将上述扩增产物利用15%琼脂糖凝胶电泳分离。选取重复性好的Bt基因组DNA扩增片段，使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。纯化产物连于pGEM-T载体，转入JM109感受态大肠埃希菌。连接反应、转化操作以及克隆子的鉴定按照常规方法进行；阳性克隆子用NaOH/SDS碱裂解法制备质粒DNA。  124 斑点杂交 按照随机引物DNA标记试剂盒说明标记回收产物，以标记产物为探针，分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。  125 引物设计及PCR验证 发生特异性杂交反应的克隆片段由大连TaKaRa生物工程有限公司进行测序。利用Primer Premier0软件〔8〕,根据特异克隆片段序列信息设计引物，序列分别为:BthⅠ：5′CGAGCAGTAGGCGAACCATTG-3′BthⅡ:5′TGGCATGGGCTTTCGGATATT-3′。引物对应的扩增产物长度为363bp；PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30循环；72℃延伸5min。体系同ERICPCR。以6株Bt及其他对照