利用大豆低值蛋白开发大豆肽-植物学专业论文.docxVIP

Developing Developing Peptide from Fermentation with Low Economic Value Soybean Protein Presented by Wu Xianjing Under the supervision of Zhu Danhua College of Chemistry and Life Sciences Zhejiang Normal University Jinhua 32 1 004，P．R．China 1h‘ Dissertation sn bmitted to Zhejiang Normal University in partial fulfillment of the requirements for the degree of master Completed in April，2010 Commencement in May,2010 - 利用大豆低值蛋白开发大豆肽摘要 利用大豆低值蛋白开发大豆肽 摘要 大豆肽是大豆蛋白水解后产生的有生理活性的小分子短肽链，具有优良的加工特 性和生理功能，是大豆深加工的一个重要方向。利用微生物发酵制备大豆肽，具有酸 解和酶解法生产所不具备的很多优点。本课题主要对菌种的选育、发酵工艺的优化和 发酵液的分离纯化分析等几个关键环节进行初步研究。 选用实验室保存的米曲霉Asp 3．042作为初始发酵菌种，对其产蛋白酶性状进行 选育。利用浙江省农业科学院作核所的辐照源对米曲霉进行诱变育种，在初筛的过程 中，以透明圈直径大小作为初选指标，经过观察透明圈直径大小，并重复筛选得到 17株诱变菌株，其菌落生长过程中产生的透明圈比原始菌株大，表明在诱变过程中 其分泌蛋白酶的能力发生突变，而有部分菌株生长性状也发生了改变。在进一步复筛 的研究中，发现初筛得到的诱变菌株发酵4天的蛋白酶酶活和发酵8天的粗肽含量基 本上都比原始菌株高，其中编号A．9的菌株其发酵得到的粗肽含量最高，是诱变得到 的最佳菌株。 利用豆渣进行米曲霉产孢子的固体发酵实验，对固体发酵培养基中豆渣、麸皮、 水分、KH2P04、MgS04的含量进行单因素试验。在优化分析后，选择米曲霉固体发 酵产孢培养基组成比例为：豆渣89，麸皮29，水份209，蔗糖5．59，lm2P04 O．39， MgS04 0．059。在豆渣固体培养基优化条件下发酵培养米曲霉孢子，计孢子数接近 3．0x108个／ml，能够达到较好的培养效果。 且米曲霉菌丝在培养基上生长良好，培养 24h后固体培养基表面就长出白色的菌丝， 在2．3天的发酵培养后，米曲霉菌丝颜色 转为黄绿色并生成分生孢子体，一般培养4天左右固体培养基表面长满绿色的孢予。 收集固体培养的米曲霉孢子，稀释至0．5x108个／IIll，接种制豆腐皮后剩余的豆 浆(下浆水)进行液体发酵培养，利用液体发酵制备大豆粗肽。采用响应面法对发酵 培养基成分进行优化。在单因素试验的基础上，首先用Plaekett．Burrnan(PB)设计对 培养基中相关影响因素的效应进行评价，筛选出3个有显著影响效应的因素，分别为 KH2P04、蔗糖、麸皮。然后进行最陡爬坡实验逼近最佳响应面区域，最后通过Box— Behnken设计及响应面分析确定了主要影响因素的最佳浓度，为KH2P04：1．18％，蔗 糖：O．24％，麸皮：1．8l％，MgS04：0．2％，NaCl．．0．2％，CaC03．-0．02％，吐温：O．05％， 起始pH值7。在优化条件下发酵8d，粗肽得率达到63．31％，含量比发酵前提高了4 倍。 在最优液体培养基条件下，对发酵不同时间的发酵提取液测定每毫升样品的总抗 在最优液体培养基条件下，对发酵不同时间的发酵提取液测定每毫升样品的总抗 氧化能力，实验发现随发酵时间的延长，每毫升发酵液的抗氧化能力也不断增强。说 明发酵过程中，发酵原料中的大分子大豆蛋白被发酵过程中产生的蛋白酶分解成短 肽，提高了发酵液的抗氧化能力。 对发酵8天的发酵液进行离心提取上清液后，进行超滤分离，得到分子量分别在 小于1000Da、1000．5000Da、5001．10000Da和10000Da以上的四个截留片段，其中 大于10000Da的大分子物质抗氧化能力弱，1000．5000Da和5001-10000Da的截留溶 液抗氧化能力较强，1000Da以下的溶液由于短肽大多分解成氨基酸，反而抗氧化能 力降低。对比1000．5000Da和5001．10000Da的截留溶液，5001．10000Da的溶液放置 一段时间，会出现蛋白质凝聚，出现沉淀，稳定性较差。而1000．5000Da的溶液较稳 定，淡黄色澄清，能放置较长时间。选择1000—5000Da的超滤片段通过