核酸扩增专业技术标准.pptVIP

核酸扩增技术;主要内容;第一节 聚合酶链反应技术 polymerase chain reaction, PCR;PCR技术发展简史;PCR技术发展简史;基本原理 ;PCR反应体系、条件及其优化;DNA RNA：总RNA、mRNA、tRNA、 rRNA、 病毒RNA ;引物（primers);引物的重要性;引物设计总原则;引物设计一般原则;引物长度 ;碱基分布的均衡性;引物Tm值;引物二级结构;引物3’端;引物5’端;引物的保守性与特异性;扩增区域的二级结构;引物与PCR;引物设计软件;DNA 聚合酶(DNA polymerase);dNTP;PCR缓冲液（PCR buffer）;PCR一般方案——反应组成;PCR;PCR反应体系、条件的优化;降落 PCR(Touchdown PCR) ;热启动PCR（hot start PCR） ;扩增产物的检测及分析 ;琼脂糖凝胶电泳 ;特点： 分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开； 上样量远大于琼脂糖凝胶； 回收的DNA纯度高； 采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。 用途：PCR扩增指纹图、多重PCR。;PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) ;单链构型多态性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP） ;核酸探针杂交法;点杂交（dot blot）;反向点杂交(reverse dot blot);微孔板杂交( microplate hybridization) ;荧光探针杂交法;PCR产物测序 ;常见问题原因分析及处理;假阳性 ;怎么可能全家人都得了性病 ???;非特异性PCR产物 ;假阴性 ;引物二聚体 ;PCR污染及预防措施 ; RNA酶的污染与预防 ;PCR衍生技术 ;巢式PCR（nested PCR）;逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） ;多重PCR(multiplex PCR) ;重组PCR(recombinant PCR) ;锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） ;不对称PCR（asymmetric PCR） ;反向PCR（reverse PCR） ;反向PCR;扩增长片段PCR（long PCR）;免疫PCR(immuno-PCR);原位PCR（in situ PCR ） ;定量PCR ;定量PCR中扩增产物的检测方法;第二节 荧光定量聚合酶链反应（Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR） ;荧光定量PCR技术基本原理;荧光扩增曲线图;Ct 值;Ct值的重现性;;初始模板量的对数与C(T)循环数之间 呈线性关系;荧光定量PCR技术 ;荧光染料法——SYBR染料;SYBR-Green I;SYBR-Green I;溶解曲线分析（Tm）;TaqMan探针法;遵循一般引物设计原则； 引物之间的Tm相差避免超过2℃； 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；;TaqMan探针设计原则;TaqMan MGB 探针设计;分子信标技术;R;Oligo 1: Fluorescein;复合探针法;其他核酸扩增技术;核酸序列依赖性扩增;连接酶链反应;分枝DNA信号放大系统;第四节 临床基因扩增实验室的管理与质量控制 ;临床基因扩增检验实验室的规范化设置;操作人员培训;临床基因扩增检验实验室质量保证 ;Thank you!