上课 血红蛋白的提取和分离.pptVIP

蛋白质分离的原理：;凝胶色谱法（分配色谱法）;提取分离方法;凝胶色谱法分离蛋白质;相对 分子质量; （二）缓冲溶液; （二）缓冲溶液; （三） 电泳：;2、原理：;3、类型:;; 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 ; SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。;实验操作步骤; 水分 血浆 固体物质 血液 白细胞 血细胞 血小板 红细胞 ;血红蛋白;1、 红细胞的洗涤 2、血红蛋白的释放 3、分离血红蛋白溶液 4、透析;问题： 1、刚采集的血样要做 怎样的处理？为什么？ 加入抗凝血剂， 防止血液凝固。 2、怎样洗涤？ 采样分离－吸浆倒红－加液搅拌－重洗三次 低速短时间离心 生理盐水;3、洗涤的目的是什么？ 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。 4、洗涤干净的标志是什么？ 直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。;2、血红蛋白的释放;有机溶剂（无色透明的甲苯层） 脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层） 血红蛋白溶液（红色透明液体） 红细胞破碎物沉淀（ 暗红色沉淀物）;血红蛋白;(4)透 析：;;2.凝胶色谱操作:;（2）凝胶色谱柱的装填;③凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意： 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ; ;（3）样品加入与洗脱;注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。;③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ;（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）;1.样品的处理——通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液 2.样品的粗分离——经过透析去除分子量较小的杂质 3.样品的纯化——通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去 4.经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。; 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。;2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？; 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。