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核酸提取及常见问题分析（一）——DNA 内容 前言 DNA提取的几种方法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－其它方法 　物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 　化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 　生物方式：酶法 基因组DNA－其它方法 　吸附材料结合法： 基因组DNA－其它方法 　浓盐法： 　　　　　　 　 　有机溶剂抽提法： 　　　　 　 　密度梯度离心法： 　　　　　　　 细胞器DNA－差速离心法 DNA提取的基本步骤 材料准备 细胞裂解 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸沉淀、溶解 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 * * 主讲人：张蕾 09年8月12日 第二部分：DNA提取方法简介 第三部分：DNA提取常见问题、 　　　　　原因分析及其对策 第一部分：前言 　　　核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。 第二部分：DNA提取方法简介 　基因组DNA的提取 　CTAB法 　SDS法 　其它 　线粒体、叶绿体DNA的提取 　差速离心结合SDS裂解法 　CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热。 　CTAB提取缓冲液的经典配方 20 mM 　EDTA （pH8.0） 0.1%（V/V）使用前加入 2%(W/V) 1.4M 100 mM 终浓度 β-巯基乙醇 CTAB NaCl Tris-HCl （pH8.0） 组份 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 　CTAB提取缓冲液的改进配方 5%(W/V) PVP40 20 mM 　EDTA （pH8.0） 2%（V/V）使用前加入 3%(W/V) 1.4M 100 mM 终浓度 β-巯基乙醇 CTAB NaCl Tris-HCl （pH8.0） 组份 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 　CTAB法流程图 植物材料 裂解液 上层溶液 液氮研磨 抽提 细胞裂解 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 SDS法原理 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 20 mM 　EDTA （pH 8.0 ） 2% 0.4M 10 mM 　终浓度 SDS 　NaCl Tris-HCl （pH8.0） 　组份 SDS法DNA提取缓冲液 SDS法流程图 （以动物组织为例） 动物组织 细胞裂解 上层溶液 组织匀浆 抽提 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 　根据细胞裂解方式的不同有： 　根据核酸分离纯化方式的不同有： 　硅质材料 　 　阴离子交换树脂 　磁珠 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。 利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离 有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用 利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物 　差速离心法原理 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。 　线粒体和叶绿体是