半定量rt-pcr试验的心得.docxVIP

半定量rt-pcr试验心得 　　半定量PCR：　　方法一：　　一总RNA提取　　1.将新鲜的悬浮培养细胞(25ml)倒进离心管中，8000g4℃离心10min,弃上清；　　2.加液氮研磨一次，按108个细胞加1mltrizol，用枪反复吹吸至裂解液无明显沉淀，室温静置10min；　　3.加200μl氯仿，剧烈震荡20s，室温放置5-10min；　　4.取上层水相，一般取400μl足够；　　5.加入等体积异丙醇，摇匀，室温放置10min；　　g离心10min；　　7.75%乙醇1ml洗涤沉淀；　　g离心5min；　　9.弃乙醇，短暂离心，吸干净残余乙醇，室温干燥3-5min;　　10.用20μldepc水溶解沉淀；　　11.电泳：110V，10-15min。(2%琼脂糖胶)　　半定量PCR　　二基因组DNA的去除　　RNA样品中痕量的基因组DNA的去除方法参照DNaseI(RNaseFree)试剂说明书进行。对除去基因组DNA的总RNA样品稀释后测定DD260nm和0D280nm，计算RNA的浓度。对初提及去除基因组DNA的总RNA样品各取5μl，2％琼脂糖凝胶，110v电压，l0min电泳后拍照。　　三第一条链cDNA合成　　①冰上按以下次序配置体系　　TotalRNAμg　　Primer(randomhexamerprimer)1μL　　Water,nuclease-free　　合计12μL　　②将体系轻柔混合短暂离心后，在PCR仪进行以下程序：65℃，5min后4℃，5min；③顺次加　　5×Reactionbuffer4μL　　Rnaseinhibitor(20u/μL)1μL　　10MmdNTPMix2μL　　ReverseTranscriptase(200u/μL)1μL　　④将体系轻柔混合短暂离心,在PCR仪进行以下程序：25℃，5min；42℃，60min；70℃，5min。　　四.内参基因和目的基因引物设计　　内参基因需是看家基因，目的基因要求PCR产物在350-800bp之间，且退火温度和内参基因引物的退火温度保持一致。　　五.内参基因和目的基因退火温度的确定　　进行不同的变性温度梯度PCR，内参基因和目的基因分管做，PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳　　六.PCR循环数的确定　　按普通PCR循环，设定为34个循环，内参基因和目的和目的基因分管作，内参　　和目的基因都做6管，在PCR的第18、20、22、24、36、28、30、32、34个循环各拿出1管，一起跑电泳。选择循环次数在线性范围内，且电泳效果好的次数作为最佳循环次数。　　七.半定量PCR　　采用以上优化好的RT-PCR条件进行PCR　　上面的是提RNA的方法是提细菌的总RNA,酵母菌也适用，提真核细胞的总RNA还可以用酸性酚法提，效果很不错　　方法二：　　半定量反转录－聚合酶链反应是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术，较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。这种方法不另设‘内标准,排除了2对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。步骤。1、抽提RNA，2、反转录获得cDNA，3、以cDNA为模板做PCR。　　注意：　　1、RNA制备：一般制备总RNA即可，有时需要制备mRNA，初学者还是选择Trizol，大量制备采用传统的方法自己配，实际上和trozol一样的，有时效果还好，trizaol的优点在于质量保证，使用方便，效率高，根据不同组织用trizol一般可以提到全部RNA的50%以上，有些可以到达80%。mRNA最好用Qiagen的柱子，是否用DNAseI根据基因的特点和引物的设计，能够跨内含子的就不需要处理，处理还是很危险的哦。像这样的微量和也用不了多少次的实验，并且如果牵涉到样品是无价之宝的时候，因该选好的进口试剂。谈到RNA的贮存实际上主要是温度，-20是不够的，至少-80，液氮最保险。　　2、反转录：常规，取样尽量一致，如上所述，不是为了定量，是为了半定量PCR时图形的好看。选择逆转录酶根据实验需要，Promega、invitrgen、Roche的都不错。反转录成功后就不必太小心了，-20就可以了。　　3、半定量RT-PCR：这是重点，此处指基于凝胶成像分析的。　　实验设计：根据不同的实验，对于不同的基因要有不同的策略，还有不同的组织，选择不同的基因的转录本，选择不同的看家基因，都各自不同，对于文献不可照抄。