利用无苞芥cDNA文库挖掘耐盐相关基因及基因功能分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 分类号： 密级： 学号：2012103052 单位代码：10759 石河子大学 硕 士 学 位 论 文 利用无苞芥 cDNA 文库挖掘耐盐相关基因及 基因功能分析 学 位 申 请 人 魏艳玲 指 导 教 师 黄先忠 教授 申请学位门类级别 理学硕士 学科、专业名称 生物化学与分子生物学 研 究 方 向 植物基因工程 所 在 学 院 生命科学学院 中国·新疆·石河子 2015 年 6 月 Function gene-mining for salt-tolerance genes and functional analysise by cDNA Library from the Olimarabidopsis pumila A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Natural Science By Wei Yan-Ling (Biochemistry and Molecular Biology) Dissertation Supervisor: Prof. Huang Xian-zhong June, 2015 摘要 高盐、干旱、冷害等非生物胁迫严重危害着农作物的生长，造成了农业经济的重大损失，因此 植物的抗逆研究具有重要的意义。无苞芥(Olimarabidopsis pumila)为新疆半干旱半盐碱化土地上广泛 生长的十字花科早春短命植物，比拟南芥更耐逆境胁迫，本研究对无苞芥均一化 cDNA 文库进行分 析，旨在挖掘耐盐相关基因。 目的：对无苞芥 cDNA 均一化文库进行大规模测序，并进行生物信息学分析和基因功能分析。通过 Gateway 技术构建无苞芥表达文库，转化拟南芥构建转化体库。在文库中找出无苞芥耐盐相关基因， 并进行基因功能的初步分析。 方法：(1)对无苞芥均一化 cDNA 文库随机挑取约 2 万个单克隆进行测序，并进行序列分析，包括去 除低质量的 EST 序列和污染序列、序列拼接和装配、BLAST 比对分析、功能注释、Gene Ontology (GO) 分类、Cluster of orthologous Groups of proteins (COG)分类，以及 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)信号通路分析。利用实时荧光定量 PCR (quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)技术 分析文库中抗逆相关基因以及 NAC 转录因子家族基因在盐胁迫下的表达水平。 (2)利用 Gateway 技术构建无苞芥目的文库，转化农杆菌后侵染拟南芥，收获转化后的拟南芥种 子后进行高通量筛选。 (3)利用 RT-PCR 方法克隆两个 NAC 转录因子基因 OpNAC026 和 OpNAC083，生物信息学分析 其特征，利用 qRT-PCR 技术分析这两个基因的表达模式，构建植物过量表达载体，获得转基因烟草 植株，并进行生理指标检测。 结果：(1)无苞芥均一化 cDNA 文库测序获得 16 146 条高质量的 EST 序列，经聚类拼接后获得 8 893 个 unigenes，包括 2 486 个 contigs 和 6 407 个 singletons。有 4 777 个 unigenes 参与 GO 分类；3 651 个 unigenes 参与 COG 分类；8 301 个 unigenes 涉及到 KEGG 信号通路分析。 (2)初始目的文库的库容量为 4.61×104 (cfu)，均一化目的文库的库容量为 5.96×104 (cfu)。目前筛 选出两株转化体植株。 (3) OpNAC026 基因全长 cDNA 为 1 327 bp，最大开放阅读框(ORF)为 906 bp，推测编码 301 个氨 基酸。系统进化树分析表明，OpNAC026 与拟南芥 AtNAC026 和 AtNAM 进化关系最近。OpNAC026 基因在无苞芥的各组织中都有表达，在叶中表达量最高；高盐胁迫处理 24 h、干旱 12 h、ABA 6 h、 4 ℃低温 8 h 明显诱导 OpNAC026 基因的表达。OpNAC026 的转基因烟草比野生型烟草耐受逆境胁 迫。 (4) OpNAC083 基因 cDNA 包含一个 723 bp 最大开放阅读框(ORF)，推测编码 240 个氨基酸。系 统进化树分析表明，OpNAC083 编码产物与拟南芥 AtNAC083 和琴叶拟南芥 ANAC083 进化关系较 近，属于同一进化分支。OpNAC083 在无苞芥不同组织中