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第三章 第四章 电镜 电镜、分辨率、透射电子、二次电子、电子束、超薄切片、免疫电镜技术 电镜：以电电子束为光源，电磁场为透镜，利用电子散射产生的信号进行显微成像的具有高分辨率和放大倍率的显微镜。电镜用于研究组织和细胞的超微结构 分辨率：用于表示人眼和光学仪器能够辨别的两点之间最小距离的标志。人0.2mm，光镜0.2um。分辨率是衡量电镜性能的重要指标。 透射电子：当样品厚度小于100nm时，部分电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子。（利用透射电子信息成像的称为透射电镜） 二次电子：在入射电子的轰击下,样品表面5-50 nm 深度激发出来的电子称为二次电子。（利用二次电子信息成像的称为扫描电镜） 电子束：又称电子射线，电子束带负电荷，具有光的波动性、可折射性。电镜利用电子束作为“光源”成像。 超薄切片：将环氧树脂包埋的组织块切成100nm以下的薄切片称为超薄切片，超薄切片经电子染色后在TEM下观察组织细胞内部的超微结构。 immune electron microscopy：免疫电镜技术是将免疫学方法与电子显微镜技术相结合，利用抗原与抗体特异结合的特性，在超微结构水平定位特异大分子的技术。 电镜在医学领域的应用 观察细胞器和组织器官的超微结构；观察病毒和细菌等；观察组织细胞超微病理结构；用于临床疾病的诊断；观察生物材料复合体及模式生物等 3. 从分辨率、放大倍率、成像信号、样品制备、图像特点和应用几方面对透射电镜和扫描电镜进行比较 TEM分辨率为0.1nm，放大倍率是100万倍，成像信号为透射电子信号成像，样品制备过程复杂，要制成50～100nm的超薄切片，图像特点为二维结构，平面图像， TEM用于观察组织细胞内部的超微结构。 SEM分辨率为 0.6nm，放大倍率是80万倍，成像信号为二次电子信号成像，样品制备方法较简单，标本可大而厚，图像特点为三维结构图像，立体感较强， SEM 用于观察样品表面及其断面立体形貌。 了解细胞内部的超微结构变化应选择哪种类型的电镜，为了保证良好的超微构，在样本取材及固定时应注意什么？如果是培养细胞，细胞数量一定要达到多少？ 了解细胞内部的超微结构变化应选择TEM。 为保证良好的超微结构，在样本取材及固定时应注意做到快、小、轻、冷。快：在1分钟内固定组织，尽可能保持其生活状态，因为瞬间的拖延都会导致细胞超微结构的变化。小：组织块必须切成1mm3的小块，组织块过大其中央得不到及时固定会发生细胞自溶现象。轻：不要牵拉、锯、挤压组织。要用锐利的刀片，避免细胞受到损伤。冷：低温操作，4℃保存，降低酶的活性，避免组织发生自溶。 如果是培养细胞，细胞数量一定要达到1×107 在透射电镜样本取材时，样本不可大于1mm3，并在1分钟以内完成固定。请问如果组织块过大会出现什么后果？没有及时固定的组织电镜下会出现何种改变？ 由于电镜固定液戊二醛对组织的穿透能力较弱，如果组织块过大会造成组织中心得不到及时固定，在电镜下没有得到及时固定组织细胞的细胞器会发生变性，特别是对缺血乏氧十分敏感的线粒体会出现肿胀和空泡变性等改变。 扫描电镜用于观察组织表面结构，因此取材时必需要充分暴露组织表面结构，请问常用的方法和注意事项有哪些？ 在样品取材时必须充分暴露并保护好观察面，避免损伤要观察的部位，易卷曲的样品, 如气管、胃、肠粘膜可固定在滤纸上展平，要将表面的血液、粘液用生理盐水或缓冲液仔细漂洗干净。 7. 什么是血管灌注固定？为什么脑、心、肾脏等组织要进行灌注固定取材？在样品制备过程中为什么要进行半薄切片定位？ 血管灌注固定是通过血管灌注适量的固定剂，在动物体内把活细胞在原位及时固定。血管灌注固定速度快，固定均匀，可减少离体或死亡后缺氧引起自发性的变化影响，特别是对脑、心肌、肾脏等对缺氧比较敏感的组织尤为重要。 半薄切片的意义在于：1 选取超薄切片的部位，超薄切片的面积一般要小于0.5mm2，要经过半薄切片来选取有意义的部位。2 对同一部位进行光、电镜对比观察，在较大范围内了解组织结构、病变部位和病理性质，有利于更确切的认识超薄切片中的结构及其相互关系。 第六章　第八章 免疫细胞化学技术间接法的优点有哪些 1 只要拥有同一种属的一抗和标记的二抗就可以操作而不必对针对各种抗原的一抗做标记，大大简化了抗体的制备 2 一个一抗分子可以和多个二抗分子结合，提高了灵敏度 3 一抗未经标记，可以避免标记造成的对抗体抗原结合的影响 免疫荧光双标技术 双标用两种荧光素分别显示不同的抗原物质，使几种待测物质可以由不同颜色的荧光素在同一张组织切片上反映出来，效果非常直观。双标要求一抗种属分开，二抗颜色分开。 3 名解ABC，LSAB，探针　 　ABC：亲和素