临床基因扩增检验标本的处理、保存和核酸提取方法及质量控制3讲述.pptVIP

临床标本中PCR反应抑制物 内源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。 外源性的 :如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。 注意事项 肝素的作用机理 肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。 对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用。 每μg核酸标本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制酶活性。 在标本中加入肝素酶I 或Ⅱ1~3 U/μg核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 ℃2小时) 可去除肝素的抑制作用。 血红蛋白、乳铁蛋白（lactoferrin） 血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内的主要PCR抑制物,它们均含有铁。 抑制机制可能是： 1）与这些蛋白释放铁离子至PCR混合物中有关。研究铁的抑制效应时，发现其干扰DNA合成，而且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（Hemin）等血红蛋白衍生物，也是PCR抑制物。 2）亚铁血红素(Heme)可通过返馈抑制调节DNA聚合酶活性及协调红细胞内血红蛋