食源性致病菌检验技术及质量控制.ppt

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食源性致病菌检验技术 及质量控制 内容 1.创伤弧菌检验 2.大肠菌群检验 3.沙门氏菌检验 4.大肠埃希氏菌O157 :H7/NM检验 5.副溶血弧菌检验 6.空肠弯曲菌检验 7.金黄色葡萄球菌检验 8.单核细胞增生李斯特菌检验 9.阪崎肠杆菌检验 10.质量控制 没有国标 食物中毒诊断 国外相关标准 美国FDA BAM网络版 第9章 弧菌 2004 NMKL 食品中致病性弧菌的检验 1997 加拿大 鱼和海产品创伤弧菌的分离计数 MFLP-73 1995 日本食品卫生检查指征 2004 选择性增菌液 碱性蛋白胨水 选择性分离培养基 硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖( TCBS )琼脂 改良纤维二糖-多粘菌素B-多粘菌素E(mCPC)琼脂和纤维二糖-多粘菌素E(CC)琼脂平板 ―探针克隆杂交显示,两种平板上均有95%以上的可疑菌落为创伤弧菌 引起胃肠炎、伤口感染和原发性败血症 人类感染是因为食用生或半生的受污染海产品,或是因为伤口接触了带菌的海水或海洋动物 罹患肝病、血色病的个体易感者及免疫功能低下者,一旦感染创伤弧菌,更容易发生致命的伤口感染和原发性败血症,后者的病死率超过50% 创伤弧菌是美国海产品消费引起死亡的首要原因,美国州际贝类卫生委员会规定,收获后经处理的牡蛎中创伤弧菌限量不超过30 CFU/g。估计日本每年创伤弧菌败血症病例数约为425例。大陆沿海地区也时有创伤弧菌散发感染的报告 创伤弧菌(Vibrio vulnificus) 1976年首次发现 引起 伤口感染 致死性的原发性败血症 胃肠道感染 曾称为乳糖阳性弧菌 革兰氏阴性嗜盐菌 兼性厌氧 3个生物型 样品制备 非冷冻样品采集后应立即置7℃~10℃冰箱保存,尽可能及早检验;冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在2℃~5℃不超过18 h解冻;如果样品需要冷冻贮存,应在样品中加等量缓冲甘油-氯化钠溶液(液体样品应加双料),推荐贮存温度为-70 ℃以下。 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物,包括贝肉和体液;甲壳类取整个动物,或者动物的中心部分,包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类,则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分,然后以无菌操作打开外壳,按上述要求取相应部分。 以无菌操作取检样25 g(mL),加入3%氯化钠碱性蛋白胨水225 mL,用旋转刀片式均质器以8 000 r/min均质1 min,或拍击式均质器拍击2 min,制备成1:10的均匀稀释液。如无均质器,则将样品放入无菌乳钵中磨碎,然后放在500 mL的灭菌容器内,加225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水,并充分振荡。 增菌 定性检测 将上述1:10稀释液于36 ℃±1 ℃培养12 h~16 h。 定量检测 用灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL,注入含有9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管内,充分混匀,制备1:100的稀释液。 另取1 mL灭菌吸管,按上条操作依次制备10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1 mL灭菌吸管。 根据对检样污染情况的估计,选择三个连续的适宜稀释度,每个稀释度接种三支含有9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管,每管接种1 mL。置36 ℃±1 ℃恒温箱内,培养12 h~16 h。 分离 对所有显示生长的增菌液,用接种环在距离液面以下1 cm内沾取一环,于mCPC或CC平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于39 ℃~40 ℃或36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。 分离平板——mCPC和CC 典型的创伤弧菌在mCPC和CC平板上呈现为圆的、扁平的、中心不透明边缘透明的黄色菌落,直径1 mm~2 mm。 纯培养 挑取三个或以上的可疑菌落,划线3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板,36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。 初步鉴定 氧化酶试验:挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验,创伤弧菌为氧化酶阳性。 涂片镜检:将可疑菌落涂片,进行革兰氏染色,镜检观察形态。创伤弧菌为革兰氏阴性,呈棒状或弧状。 挑取纯培养的单个可疑菌落,转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层,36 ℃±1 ℃培养24 h观察结果。创伤弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑,无气泡,斜面颜色不变或红色加深,偶尔斜面变黄。 V-P试验:以接种针由3%氯化钠三糖铁琼脂斜面挑取少许培养物穿刺3%氯化钠MR-VP培养基,36 ℃±1 ℃培养24 h,在加V-P试剂前应先观察动力。沿穿刺线周围呈扩散性生长为动力阳性。 嗜盐性试验:挑取纯培养的单个可疑菌落,分别接种于不同氯化钠浓度的胰胨水,36 ℃±1 ℃培养24 h,观察液体混浊情况。创伤弧菌在无氯化钠、8%氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长,在6%氯化钠的胰胨水中生长

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