荧光化学发光在植物分子生物学的运用资料文档.pptVIP

1、荧光技术 FI应用的优势 FI应用－核酸定量分析 2）时间分辨荧光（TRF） 3）荧光偏振（FP） 4）荧光共振能量传递（FRET） 5）均相时间分辨荧光（HTRF） 2、化学发光技术 发光应用－基因调控 BRET应用示例－蛋白质相互作用 技术总结 Tecan多功能酶标仪家族 多功能酶标仪支持的微孔板类型 以GFP为基础的Ca++显示剂（cameleons） 将一个青色荧光蛋白通过钙调蛋白（CaM）和CaM结合肽（M13）连结到一个黄色荧光蛋白上。 Ca＋＋与CaM的结合导致CaM与M13结合，分子构型变化，使两个GFP分子更接近，就会发生荧光共振能 量转移。 化学发光技术的分类 发光 发光共振能量传递 1）发光（Lum） Substrate Product + Light Enzyme 优势：超高灵敏度 Lum应用范围 钙流检测 基因调控 ATP检测 发光免疫分析 发光应用－钙流检测 水母发光蛋白Aequorin Ca++ Kinetics of the β-glucan（葡聚糖）elicitor-induced enhancement of the [Ca2+]cyt in soybean cells. （Biological Procedures Online 2002- 4/1, p105-118） 发光应用示例－钙流检测 pSP-luc+ (转化拟南芥细胞) Cultured cells show diurnal rhythms (Arabidopsis) (Plant Cell Physiol, 2004-45/1, p57-67) CCA1的启动子区域 CCA1－在昼夜节律调节起中心作用的转录因子 发光应用示例－基因调控 2）发光共振能量传递（BRET） Donor = Renilla luciferase (Rluc) Acceptor = YFP BRET应用范围 蛋白组学: 蛋白-蛋白相互作用 胞内细胞器间的相互作用 对酵母双杂交结果的验证 受体研究: 受体的同源和异源二聚体化 受体应答传导途径 孤儿受体的筛选 发光光谱 （关注530/480 ratio） COP1的二聚体化 COP1-光形态建成的关键抑制因子 COP1蛋白突变体的二聚体化研究 (PNAS, 2004-101/17, p6798–6802) BRET应用示例－蛋白质相互作用 cytoplasmic localization signal (CLS) 荧光技术 利用荧光物质进行特异性标记；特异性好，灵敏度高；特别适合于细胞研究和分子间相互作用研究。 发光技术 灵敏度超高，特别适合于基因表达和基因调控研究。 针对各种光检测技术的Total Solution 通用型检测系统 功能全面的滤光片型检测系统 独一无二的全光谱扫描型检测系统 384 96 48 24 12 6 1536 从6孔-48孔的细胞培养板、96孔酶标板到384、1536板等高密度筛选板 谢谢大家！ haixu_chen@ FP－淀粉酶，SNP FRET－钙流，DNA探针 HTRF－ Lum－钙流，Luciferase，BRET Ns-us 溴化乙锭 观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的NDA条带。 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链DNA或RNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。 尽管在该染料存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低15%，因此，当需要知道DNA片段的准确大小（如DNA限制酶酶切图谱的鉴定），凝胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色。染色