【专家讲座】核酸检测实验室建立与应用.pptVIP

* * * * * * * * * * * * HBV DNA检测阳性献血者追踪概况 追踪时间(d) ALT（IU/L） HBsAg HBsAg 抗-HBs 抗-HBc HBeAg 抗-HBe DNA（cp/ml） 1(03/10/23) 18 － － － ＋ － ＋ + 21 24 － － － ＋ － ＋ 150 45 28 ＋ － － ＋ － ＋ 未检出 91 26 ＋ － － ＋ － ＋ 未检出 156 31 ＋ － － ＋ － ＋ 未检出 214 29 ＋ － － ＋ － ＋ 未检出 * * 1号献血者在追踪时表明曾经是大三阳,治疗转阴后献血,被核酸检出阳性,7天后 HBsAg 检测(+). * * * * 1.Pooling by STAR processor 2.Virus enrichment by centrfugation 3. Extracted by KHB-1000 4. Amplified and detected by ABI7300 * * * * 1.pooling and extraction by STAR LET 2. Amplification and detection by ABI7300 Automation process * * * * * * * MANY THANKS! 问 题? * * 谢谢大家！ * * * * * * * * * 核酸检测实验室建立与应用 * * 核酸扩增检测实验室的建立 人员 场地 检测方法选择 实施方案 依据：卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号） * * 核酸实验室人员要求 资质:经过临检中心PCR培训班培训并取得上岗证；通过血站核酸实验室岗前培训考试合格。 培训:①无”核酸”的概念形成, ②防污染的概念③良好工作习惯的培养. ④报告的正确发放. 后备人员的培养. * * 试剂准备区 标本制备区 扩增区及扩增产物分析区 样本离心交接区 报告发放区 核酸实验场地 * * 方法选择: TMA与PCR TMA PCR 扩增原理 模拟自然 DNA 转录成 mRNA 的过程 模拟自然 DNA复制的过程 靶目标 RNA DNA 酶 MMLV逆转录酶及T7 RNA聚合酶 DNA聚合酶 反应体系 两种酶，两条引物，dNTP, NTP 一种酶，一对引物，dNTP 温度条件 恒温（41.5℃ ） 循环导热 （变性，退火，延伸） 扩增仪器 水浴箱或者加热块 热循环仪 扩增产物 RNA DNA 扩增速度 每个循环可以生成100-1000个复制物，在15-30分钟内可增加10亿倍复制物 以2n扩增，2～3 h就能将待扩目的基因扩增放大10亿倍 * * TMA的优点 缺点 自动化程度高 灵敏度高 扩增效率高：10n 不能绝对定量 * * PCR的优点 缺点 易于自动化 灵敏度高 扩增效率高 汇集拆分过程繁琐 拆分可减低非反应性比率 * * 核酸试剂质控 试剂的确认 试剂运输过程的控制(温度\条件\时限) 灵敏度的要求 内标的要求 试剂涵盖的基因型 * * 检测流程(1):常规筛查合格汇集标本检测流程 * * 检测流程(2):常规筛查合格单人份标本检测流程 * * 检测流程(3):平行检测流程 样本清点交接 核酸单份检测 常规检测 合格标本 不合格标本 阴性标本 反应性标本 合格标本发布结果 单项目反应性 无反应性 阳性或可疑结果淘汰 阳性或可疑结果淘汰 * * 标准操作规程(SOP)的编写 核酸实验室设置与管理规范 核酸实验室标本检测流程 核酸实验室岗位职责 核酸实验室关键试剂管理规范 核酸实验室仪器设备管理规范 核酸实验室检测标本管理规范 核酸实验室室间质量评价规范 核酸实验室记录管理制度 核酸实验室生物防护规范 核酸反应性献血者追踪规程 核酸实验室检测应急措施 * * 标准操作规程(SOP)的编写 核酸标本离心交接操作规程 核酸标本提取及汇集操作规程(科华) 核酸标本扩增检测操作规程（科华） 核酸标本全自动检测分析系统操作规程（CHIRON） 核酸标本检测报告发布操作规程（唐山软件） 核酸标本检测复检操作规程 生物安全柜标准操作规程 可移动紫外线灯标准操作规程 低温高速离心机标准操作规程 ABI 7300型核酸扩增荧光检测仪标准操作规程 * * 核酸实验室防污染措施 主要的污染源 扩增产物 标本之间产生的气溶胶 操作人员 手 衣服 * * 核酸实验室防污染措施 要有独立的空气处理