山羊痘病毒P32基因克隆、测序及表达-预防兽医学专业论文.docxVIP

目录 目 录 ii ii 表达蛋白的 SDS分析 22 1.2.6 P32 表达蛋白的抗原性分析 22 蛋白的纯化 22 纯化 P32 蛋白的抗原性检测 23 2 结 果 24 2.1 PCR 扩增结果 24 2.2 P32 的克隆测序 25 2.2.1 目的 DNA 的克隆 25 2.2.2 重组质粒的 PCR 鉴定 25 2.2.3 重组质粒的酶切鉴定 25 2.3 P32 基因的生物信息学分析 26 2.3.1 P32 基因的同源性分析 26 2.3.2 P32 蛋白的跨膜结构预测 27 2.3.3 P32 蛋白的亲水性分析 27 2.3.4 P32 蛋白抗原指数、骨架柔韧性、表面可能性预测 28 2.3.5 P32 蛋白二级结构的预测 28 2.3.6 P32 蛋白 B 细胞抗原表位的综合评价 29 2.4 P32 基因的原核表达 30 2.4.1 P32 基因的 PCR 扩增结果 30 2.4.2 重组表达质粒的 PCR 鉴定 30 2.4.3 重组质粒的酶切鉴定 31 2.4.4 P32 蛋白的表达结果 32 蛋白的表达 32 表达时间的优化 32 IPTG 剂量的优化 33 2.4.5 表达产物的 Western-Blotting 分析结果 34 2.5 P32 基因的真核表达 34 2.5.1 目的基因的 PCR 扩增结果 34 2.5.2 阳性重组质粒的鉴定 35 重组质粒的 PCR 鉴定 35 重组质粒的双酶切鉴定 36 测序 36 2.5.3 重组酵母菌的 Mut 型鉴定结果 36 2.5.4 重组酵母菌基因组 PCR 鉴定结果 37 2.5.5 表达蛋白的 SDS分析结果 37 2.5.6 表达蛋白的 Western-Blotting 分析结果 38 2.6 表达蛋白的抗原性研究 38 2.6.1 蛋白纯化的结果 38 2.6.2 P32 蛋白的抗原性检测 39 P32 蛋白的反应原性检测结果 39 P32 蛋白的免疫原性分析 39 3 讨 论 41 贵州大学20 贵州大学 2009 届硕士研究生毕业论文 iii iii 3.1 关于 GPV 基因组及 P32 基因 41 3.2 关于 P32 基因的生物信息学分析 41 3.3 关于 P32 基因的原核表达 43 3.4 关于 P32 蛋白的毕赤酵母菌表达 44 3.5 关于 P32 表达蛋白的纯化及抗原性 45 4 结 论 46 综 述 47 主要参考文献 63 致 谢 71 附录一 参与发表文章情况72 附录二 本文用到的部分英文缩写及含义说明74 I I 山羊痘病毒 P32 基因克隆、测序及表达 摘 要 目的：山羊痘是由羊痘病毒属山羊痘病毒（ GPV）引起的一种高度接触性传染病， 呈地方性流行，对养羊业造成严重的危害和巨大经济损失。为了解山羊痘病毒贵州 分离毒株与国内外毒株的序列关系和 P32 蛋白的抗原性，本研究开展了 GPV P32 基 因的克隆、测序、序列分析、体外表达及表达蛋白的抗原性研究，期望获得利用该 基因建立山羊痘基因工程疫苗及诊断方法的理论依据。 方法：应用 PCR 方法扩增山羊痘病毒贵州分离株 QL 株、LD 株和参考毒株 Y 株、 B 株 P32 基因，克隆至 pMD18-T 载体，构建重组质粒 pMD18-T-P32，将重组质粒转 化到 DH5α感受态细胞，经 PCR 和酶切初步鉴定为阳性的重组菌进行序列测定，并 将所得序列与 GenBank 收录的国内 GPV 的 P32 基因进行序列分析；选择贵州代表 毒株 LD 株 P32 基因的推导氨基酸序列为材料，应用计算机技术和生物学软件预测 P32 蛋白的跨膜结构、亲水性、抗原指数、柔韧性、表面可及性和二级结构，并综 合评价 P32 蛋白可能存在的 B 细胞抗原表位；以含山羊痘病毒贵州 LD 株 P32 基因 的质粒 pMD18-T-P32/LD 为模板，应用 PCR 方法扩增 P32 基因，将基因片段克隆至 原核表达载体 pET-28a 和毕赤酵母菌表达载体 pPICZαA，构建重组表达载体，分别 转化至大肠杆菌 BL21(DE3)中并诱导其表达，应用 SDS和 Western-Blotting 试 验分析蛋白表达情况；通过 Ni 柱亲和层析和 G-100 层析技术对表达蛋白产物进行纯 化，分别应用琼脂双扩散试验和免疫动物实验检测纯化蛋白的抗原性。 结果：将 GPV-QL、GPV-LD、GPV-Y 和 GPV-B 毒株的 P32 基因序列分析显示，GPV 贵州分离株之间核苷酸同源性高达 99.9%，与国内其它 GPV 分离株的核苷酸同源性 达到 99.7%~100%，与国外 GPV 分离株