第二章基因工程final.pptVIP

DNA连接酶 E. coli DNA 连接酶 只能催化互补粘性末端之间的连接 DNA 连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA片段紧靠在一起的3‘-OH 末端与5’-P末端之间形成磷酸二酯键，使末端连接。 T4 DNA 连接酶 催化互补粘性末端和平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低 。 具有互补粘性末端片段的连接 E. coli DNA 连接酶 具有互补粘性末端和平末端片段的连接 EcoRI EcoRI T4 DNA 连接酶 末端转移酶 + 核酸外切酶 + DNA片段末端修饰后进行连接 核酸外切酶（exonuclease）：在核酸水解酶中，是具有从分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的酶的修饰作用 CTAG AAGC 共同的限制性内切酶酶切位点 DNA连接酶 DNA片段末端加杆后连接 外切酶修饰 酶切 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体 1、条件： ②含有限制性内切酶的位点 ①能自我复制 ③含有筛选标记，一般为抗性基因或报告基因 ④能启动外源目的基因的转录和翻译 ⑤能在宿主细胞内复制并稳定地保存 2、种类 质粒、噬菌体、病毒、不同DNA片段组合载体 运载体-基因克隆载体 质粒是能自主复制的双链环状DNA分子 质粒克隆载体 大肠杆菌质粒载体 可以克隆10kb以下的片段 细菌人工染色体克隆载体 一般在10kb以下，能承载40kb左右的外源片段。 其他种类的载体包括：PCR克隆载体、噬菌体克隆载体、细菌克隆载体、病毒克隆载体、穿梭克隆载体、细菌人工染色体、细菌表达载体、真核表达载体、昆虫细胞载体、酵母表达载体、体外表达载体、荧光蛋白载体、双杂交载体、信号转导载体、siRNA表达载体、热休克载体、报告基因载体、亚细胞定位载体、转座子构建载体、噬菌体展示载体 载体种类 基因操作的基本步骤 获取目的基因 形成重组DNA分子 将重组DNA分子导入受体细胞 4.筛选含有目的基因的受体细胞 5.目的基因的表达 将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来 取出DNA 用限制酶切断DNA 目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。 提取目的基因的方法 1、直接分离基因 细胞内总DNA的提取分离程序 原理：通过基因重组, 让目的基因在受体细胞中高效稳定表达。 操作水平：DNA分子水平 结果：定向地改造生物的遗传性状，获得所需要的品种。 利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，经连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞（转化），以期获得基因表达的过程。 什么是基因工程? 基因工程(gene engineering) 常和以下名称混用 遗传工程(genetic engineering); 基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(gene manipulation); 重组DNA技术(recombination DNA technique) 克隆(clone): 作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系。 作动词时是指基因的分离与重组过程。 血液 供血者 受血者 注射器 目的基因 供体 受体 载体 基因工程（打比方） 将供体或在细胞外产生的 核酸（物质）分子 插入到病毒(virus)、质粒(plasmid)或 其它载体系统(vecter system)中 从而形成一种新的可连续繁殖的有机体 再整合到那些本来不含该类物质的宿主(host) —受体中 基因工程的诞生与发展 20世纪70年代，Paul Berg及其同事第一个创造重组DNA分子 Paul Berg 基因工程的诞生与发展 1973年,美国 Herber Boyer教授和Stanley Cohen教授在人类历史上第一次进行了有目的的基因重组尝试，并据此提出了“基因克隆”的策略。 Herbert W. Boyer, Ph.D. 基因工程的诞生与发展 1975，发现分子克隆工具酶 利用限制性内切