Western-blot实验方法步骤.pptVIP

Western-blot 试验 概论 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条件下进行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题。 具有从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白质反应均一性，固相膜保存时间长等优点。 被广泛地用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。 溶解蛋白策略 1 使用剧烈的条件以确保细胞蛋白能全部裂解下来，但这可能导致免疫反应性的丢失。 2 采用温和的条件以助于保持蛋白质的天然状态，但这造成蛋白质从细胞上的脱落效果欠佳。 机械破碎细胞，可释放出蛋白酶从而使靶蛋白降解。细胞表面蛋白和分泌蛋白通常比细胞内蛋白具有更好的抵抗力，变性蛋白比天然蛋白更容易降解。 往往可以根据靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性质来调整提取的条件。 为尽可能减少可能出现的问题，可设法采用多克隆抗血清或多种单克隆抗体的混合物，因为他们可与某一蛋白的多种形式起反应。 溶解方法 溶解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质： 1 表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解。 2 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后制备提取液。 3 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液。 4 哺乳动物细