鲤春病毒血症病毒G蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备-水产养殖专业论文.docxVIP

目录 目录 目录 摘要 I Abstract II 目录 III 第一章 前言 1 1 鲤春病毒血症概况 1 1.1 病原 1 1.2 流行特点 2 1.3 症状及病理变化 2 2 G 蛋白的研究进展 2 2.1 结构与功能 2 2.2 G 蛋白的体外表达 3 2.3 G 蛋白在鲤春病毒血症预防上的应用 4 2.3.1 用于鲤春病毒检测 4 2.3.2 在构建 DNA 疫苗上的应用 5 3 单克隆抗体技术在水生生物病毒研究中的应用 6 3.1 水生动物病毒的检测方法的建立 6 3.2 在病毒变异分型及生物治疗上的作用 6 3.3 在蛋白定位及功能分析上的应用 7 3.4 疫苗研制中的应用 7 第二章 鲤春病毒血症病毒 G 蛋白的克隆、表达及纯化 8 1. 材料与方法 8 1.1 材料 8 1.2 方法 8 1.2.1 SVCV 的增殖与鉴定 8 1.2.2 G 基因的生物信息学分析及引物设计 9 1.2.3 G 蛋白片段的扩增 9 1.2.4 重组表达质粒的构建及表达 10 1.2.5 包涵体的制备 10 1.2.6 蛋白透析复性及纯度分析 11 1.2.7 Western-Blot 11 2 结果 12 2.1 鲤春病毒的增殖与鉴定 12 2.2 G 蛋白全长 cDNA 序列的克隆及生物信息学分析 12 2.3 G 蛋白片段的扩增 14 2.4 重组表达质粒的构建 14 2.5 重组蛋白的表达及纯化 15 3 讨论 17 3.1 SVCV 增殖与 G 基因的克隆 17 3.2 鲤春病毒 G 蛋白高效表达的影响因素 17 3.3 包涵体的处理与复性 18 第三章 抗 SVCV-G 蛋白单克隆抗体的制备 20 1. 材料与方法 20 1.1 材料 20 1.2 方法 20 1.2.1 动物免疫 20 1.2.2 筛选方法的建立 20 间接 ELISA 方法的建立 20 Dot-ELISA 方法的建立 21 III 细胞爬片的间接免疫荧光实验 21 1.2.3 细胞融合操作程序 22 饲养细胞的制备 22 SP2/0 瘤细胞的制备 22 免疫脾细胞的制备 22 细胞融合 23 培养与观察 23 融合细胞的检测 24 1.2.4 有限稀释法的步骤 24 1.2.5 杂交瘤细胞的冻存 24 1.2.6 杂交瘤细胞的复苏 24 2.1 单抗与复性蛋白的间接 ELISA 结果 25 2.2 单抗与复性蛋白的间接 ELISA 结果 25 2.3 单抗与复性蛋白的间接 IFA 结果 25 3 讨论 26 3.1 免疫程序的制定 26 3.2 影响细胞融合的因素 26 3.3 筛选方法的建立 26 3.4 阳性杂交瘤细胞株的冻存及复苏 27 第四章 单克隆抗体的特性分析 28 1 材料与方法 28 1.1 材料 28 1.2 方法 28 1.2.1 抗体的效价 28 1.2.2 抗体亚型分析 28 1.2.3 特异性分析 29 1.2.4 稳定性 29 2 结果 30 2.1 抗体效价测定 30 2.2 抗体亚型分析 30 2.3 抗体特异性分析 31 2.4 稳定性分析 31 3 讨论 32 结 语 33 参考文献 34 附 录 39 独创性说明 41 学位论文版权使用授权书 42 攻读硕士学位期间发表的学术论文 43 致谢 44 前言 前言 1 鲤春病毒血症概况 第一章 前言 鲤春病毒血症(Spring Viremia of Carp，SVC)是由鲤春病毒血症病毒（Spring Viremia of Carp Virus，SVCV）引发的危害鲤科鱼类的一种急性、高致死性的传染病[1]。目前该病在 欧洲、亚洲及北美广泛流行，对鲤科鱼类养殖造成巨大的经济损失。因此世界动物卫生组 织（World Organization for Animal Health）将其列为必须申报的重要疫病，也是《中华人民共 和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》(2008)中的一类动物疫病[2]。因该病多在在 春天气温升高时发生，故得名鲤春病毒血症。 1.1 病原 SVCV 属于弹状病毒科（Rhabdoriridae）、水泡性病毒属（Vesiculorirus）的暂定种，为 单股负链 RNA 病毒[3