流式基础原理.pptVIP

双参数散点图分析 等高图和密度图 流式细胞仪的组成和工作原理 液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，而激光聚焦于流动池中心的样本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。 光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增管（PMT）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号 电子系统：荧光信号和散射光信号经二极管和PMT接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器转换为可被计算机识别的数字信号，以列表模式存储，最终以图形形式呈现 流式对照的设置 荧光染色对照的设置1 阴性对照 空白对照 自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强 实验样本 特异荧光，即抗体F(ab’)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光 非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光 自发荧光＋特异荧光＋非特异荧光 同型对照（自发荧光＋非特异荧光） 合适？ 同型对照 同型对照（Isotype Control） ： 与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 （即Fc段相同， F(ab’)2段不同） 与染色的单克隆抗体 ①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 ⑤但由未免疫动物血清纯化而来 用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色 例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1（γ1）和IgG2a（ γ2a），并分别标记FITC和PE 商业化荧光素的发射光谱 spectral overlap Fluorescence Spectrum Viewer spectral overlap 如何解决？ BD Biosciences Immune Function * （每个细胞上的抗原不同，一个一个细胞讲） * 时间有限， 流式基本概念 流式细胞术的基本概念 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。 流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 流式细胞术的特点 检测速度快，分析样本量大： 在极短时间内可分析大量细胞，这是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟成千上万个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个 可同时分析单个细胞的多种特征： 使用不同荧光素标记的单克隆抗体或荧光染料对细胞进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确 强大的分选功能： 在分析的同时可以对特定群体加以分选 流式检测的样本 可检测的样本种类多样： 各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等 New!血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 样本制备： 单细胞悬液（天然，机械研磨/消化） 5×105～1×107cells/ml，约0.5～1ml，300目筛网过滤 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 …… 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内/外的细胞因子 激素结合位点、细胞受体 蛋白磷酸化 pH值 钙离子浓度 细胞膜电位、线粒体膜电位 …… 流式细胞仪的检测信号 散射光信号 当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束 方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为 侧向角散射光信号（SSC）。 散射光信号 Right Angle Light Detector ? Cell Complexity SSC Forward Light Detector ? Cell Surface Area FSC Incident Light Source 前向角散射光（FSC, Forward Scatter）