琼脂糖凝胶电泳检测DNA-课件.ppt

一、实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术，检测质粒DNA或PCR产物。 二、原理 带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法 泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比，与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率，在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率 影响泳动率的因素包括样品的物理性状、支持物介质、电场强度和缓冲液离子强度 DNA的凝胶电泳常使用两种支持介质：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应 在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型 琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子 可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系 琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分离范围参数 凝胶浓度（%）线性DNA长度（bp） 0.5 1000～30000 0.7 800～12000 1.0 500～10000 1.2 400～7000 1.5 200～3000 2.0 50～2000 质粒DNA分子有三种构型，即CCCDNA、OCDNA和LDNA，这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的泳动率不同，因此电泳后呈三条带，CCCDNA泳动最快，其次是LDNA，最慢的是OCDNA EB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNA 注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套 CCCDNA LDNA OCDNA 电泳方向 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED的作用下聚合而成 可以分离小片段（5～500bp）DNA分子 聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用： 蛋白质分子的分离鉴定 蛋白质分子量的测定 核酸的分析 核酸序列测定 三、仪器、材料与试剂 微波炉 琼脂糖凝胶电泳系统 凝胶成像系统 质粒DNA DNA marker 50×TBE 6×凝胶加样缓冲液 琼脂糖 1％溴化乙锭溶液 溶解琼脂糖 分离质粒DNA片段 检测质粒DNA片段 电泳样品 DNA相对分子质量标准物 电泳缓冲液 沉淀DNA并起指示作用 电泳支持介质 嵌入DNA中，在紫外灯下显色 四、实验步骤 将1g 琼脂糖加入100ml 1×TBE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解（冷却到60℃，加入5μl的1％ EB，并摇匀），则为1％琼脂糖凝胶液 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶0.5cm，小心垂直向上拔出梳子 用移液器吸取质粒样品5ul于塑料板上，再加入3μl 的6×加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔 打开电源开关，调节电压至3～5V/cm（本实验用电压110V），可见溴酚蓝条带由负极向正极移动，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳 将凝胶置于凝胶成像系统中，打开紫外灯，DNA存在处显出桔红色荧光条带。 五、思考题 EB的中文名称是什么？使用EB时应注意些什么？ 什么是Loading Buffer？Loading Buffer中含有哪些成分？各组分的作用是什么？ ？