限制酶的多种切割方法以及在高中生物试题中的体现.docVIP

限制酶的多种切割方法以及在高中生物试题中的体现 周荷静（相城区陆慕高级中学?? 215131） 摘要： 本文总结了限制酶的多种割切方法，并分析其优缺点，并结合相关生物试题，对其更加深入理解。 关键字：限制酶 单酶切 双酶切 高考题 限制酶是基因工程中的工具酶之一，为了让目的基因能连接到运载体上，需要用限制酶分别切割含目的基因的DNA片段和运载体，切割方法有多种，现就其切割方法进行总结，分析其优缺点。近几年高考生物试题中几乎年年涉及到限制酶的切割方法，这应该引起教师的注意。 1???????? 单酶切? 1.1??????? 同一种限制酶分别切割目的基因与运载体 这是最简单的一种方法，用同一种酶切割后能产生相同的粘性末端，末端之间能发生碱基互补配对而形成重组DNA分子。 1.2??????? 用同裂酶分别切割目的基因与运载体 同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。? 同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是? 5’……G|CG?G……3’? 和 3’……G?GC|G……5’?，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。 例1? （2009年江苏生物高考题）苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图ampr为抗氨苄青霉素基因)，据图回答下列问题。 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? (2) 图中②表示HindIII与Bam I酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得_______种重组质粒；如果换用Bst I与BamH I酶切，目的基因与质粒连接后可获得_______种重组质粒。 解析 题中考查的是相同的粘性末端才能发生碱基互补配对而连接这一知识点。用HindIII与Bam I酶切，则质粒产生两个粘性末端，分别是H和B，也就是说能与质粒连接的DNA分子的粘性末端也只能是H和B，用HindIII与Bam I酶切含目的基因的DNA片段，可得到4种DNA片段，他们的粘性末端分别是B、B和H、H和B、B，因此有中间的两个DNA片段可以与质粒连接，形成2种重组质粒。如果换用Bst I与BamH I酶切，属于同裂酶，产生相同的粘性末端，切割后的质粒两侧的粘性末端都是B，用Bst I与BamH I酶切含目的基因的DNA片段，可得到3种DNA片段，他们的粘性末端分别是B、B和B、B,因此只有中间的DNA片段才能与质粒连接，形成1种重组质粒。 1.3? 用同尾酶分别切割目的基因与运载体 有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶。同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。??? 例2?? （2005年天津理综）限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。 ①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。 ②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。 ③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？ 解析 这两种酶属于同尾酶，能产生相同的粘性末端，因此能够连接起来。 ① ? ② ? ③由于两者产生的粘性末端相同，因此粘性末端之间能发生碱基互补配对而连接。 例3? （2010年江苏生物奥赛初赛）限制酶SalⅠ识别的序列是GTCGAC，酶切后在5’侧产生4个碱基突出，限制酶XhoⅠ识别的序列是CTCGAG，酶切后也在5’侧产生4个碱基突出。如果将SalⅠ酶切后的插入片段与XhoⅠ酶切过的质粒载体混合，在进行连接反应，那么产生的连接产物所具有的性质是： A．使用XhoⅠ或SalⅠ处理，插入物都会释放出来 B．SalⅠ处理可以使插入物释放出来，但XhoⅠ不行 C．XhoⅠ处理可以使插入物释放出来，但SalⅠ不行 D．无论使用SalⅠ或XhoⅠ处理，插入物都不会释放出来 解析 此处用同尾酶切割，能产生相同的粘性末端—TCGA，因此能连接，但重组后的序列是CTCGAC ?因此没有上述两种酶的切割位点。 ?GAGCTG， 1.3??????? 单酶切的优点与缺点 优点是操作简单。但它的缺点主要有两个：①用单酶切切割后的目的基因两侧各有一个粘性末端，而且是相同的末端，因此这两个末端会发生碱基互补配对而使目的基因首位相连，形成自身连接体，成环状；同样的道理，切割后的质粒在DNA连接酶的作用下也会首尾连接，又恢复成没有切割前的样子。②容易形成2种重组DNA分子，其中一种重组DNA分子是我